閔喆，王淑楠，吳軍，黃曉江，方瑜，邱占東，張?zhí)K明

·論著·

Tg-SwDI小鼠的筑巢行為研究

閔喆1，王淑楠1，吳軍2，黃曉江1，方瑜1，邱占東1，張?zhí)K明1

目的：研究不同年齡組Tg-SwDI小鼠與同齡野生型（WT）小鼠筑巢行為的差異。方法：將小鼠按基因（Tg-SwDI和WT）和年齡（2～4月齡、10～12月齡、18～20月齡）分為6組，利用固有筑巢材料在群養(yǎng)小鼠家籠中進(jìn)行集體筑巢行為實(shí)驗(yàn)，之后利用紙巾進(jìn)行個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：基因（F1,31=37.03，＜0.0001）和年齡因素（F2,31=3.88，＜0.05）對(duì)群體筑巢評(píng)分均有影響。Tg-SwDI小鼠與WT小鼠相比，各年齡組均有群體筑巢功能的下降。在個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)中，2～4月齡和10～12月齡Tg-SwDI小鼠的個(gè)體筑巢功能下降不明顯，18～20月齡組有顯著變化。方差分析提示顯著的基因（F1,135=23.64，＜0.0001）和年齡（F2,135=15.46，＜0.0001）影響。結(jié)論：Tg-SwDI小鼠可較早出現(xiàn)集體筑巢行為受損，可能反映其早期社交行為改變，與執(zhí)行功能相關(guān)的個(gè)體筑巢行為較晚才出現(xiàn)明顯下降。

阿爾茨海默??；Tg-SwDI小鼠；筑巢行為

隨著人口老齡化的加速，阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生活質(zhì)量的醫(yī)學(xué)難題。圍繞認(rèn)知功能下降這一核心癥狀，執(zhí)行功能受損和日常生活能力降低及行為和精神癥狀（behavioral and psychological symptoms of dementia，BPSD）等均給患者及看護(hù)者帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。目前對(duì)AD患者的治療越來(lái)越提倡多靶點(diǎn)全方面管理理念，即除了對(duì)認(rèn)知功能下降進(jìn)行治療，還應(yīng)對(duì)社交行為、情緒及精神行為異常等癥狀進(jìn)行治療；治療手段除藥物治療外，還應(yīng)重視護(hù)理、認(rèn)知康復(fù)鍛煉等非藥物干預(yù)方法的運(yùn)用[2]。目前對(duì)AD復(fù)雜臨床癥狀的機(jī)制和治療方法的研究在很大程度上有賴于動(dòng)物模型來(lái)完成，AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的出現(xiàn)可幫助人們更好地了解AD的病理生理機(jī)制以及尋找有效的治療手段[3]。對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)的研究，也不能僅局限于對(duì)學(xué)習(xí)能力和記憶力相關(guān)的認(rèn)知行為研究，還應(yīng)更多關(guān)注日常生活行為、社交行為和非認(rèn)知行為等方面的研究。

筑巢，是小鼠常見(jiàn)的一種日常行為，它不僅是一種具有庇護(hù)幼崽作用的母性行為，而且是維持體溫的本能行為，群居小鼠的集體筑巢更具有社會(huì)交流性質(zhì)[4]。小鼠筑巢行為的生理學(xué)基礎(chǔ)復(fù)雜，可能受到許多腦區(qū)和神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)的控制。近來(lái)陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道在幾種不同的AD轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)筑巢行為異常，但研究結(jié)果存在一些矛盾，其病理生理機(jī)制及其在AD研究中的應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步闡明。筑巢行為實(shí)驗(yàn)研究方法簡(jiǎn)便易行，且過(guò)程幾乎無(wú)創(chuàng)，可反映小鼠的社會(huì)行為和日?；顒?dòng)能力，為研究AD的動(dòng)物行為學(xué)研究提供了一種新的手段。

以往的多數(shù)小鼠轉(zhuǎn)基因模型都聚焦在腦實(shí)質(zhì)老年斑的模擬上，而用于研究腦淀粉樣血管病 （cerebral amyloid angiopathy，CAA）相關(guān)病理變化的模型相對(duì)較少。Tg-SwDI轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)瑞典型（Swe K670N/M671L）、荷蘭型（Dutch E693Q）和愛(ài)荷華州型（Iowa D694N）3種不同的人APP突變基因，同時(shí)具有腦實(shí)質(zhì)Aβ沉積與顯著的腦血管Aβ沉積，并伴有進(jìn)行性加重的膠質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞增生，是一種較新的研究AD和CAA的良好模型[5]。Tg-SwDI轉(zhuǎn)基因小鼠自面世以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)其病理學(xué)特點(diǎn)做了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他AD轉(zhuǎn)基因模型，其很早（3月齡）就在海馬下托出現(xiàn)CAA樣病理變化伴膠質(zhì)細(xì)胞增生活化，隨著年齡的增長(zhǎng)，在海馬齒狀回、丘腦、皮質(zhì)、嗅球等區(qū)域均逐步出現(xiàn)Aβ沉積且進(jìn)行性加重，與之相伴隨的是在巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)出早發(fā)的空間學(xué)習(xí)與記憶功能下降。此后人們利用這種動(dòng)物模型通過(guò)各種方法繼續(xù)研究AD及CAA的相關(guān)病理機(jī)制，并用它來(lái)探討和評(píng)價(jià)一些AD潛在治療方法的有效性和作用機(jī)理。但對(duì)于其行為學(xué)表現(xiàn)特征卻研究得并不充分。關(guān)于這種小鼠的筑巢功能的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，本研究選擇3個(gè)不同年齡組Tg-SwDI小鼠和相應(yīng)的野生型（wild type，WT）小鼠進(jìn)行筑巢行為的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

純合子 Tg-SwDI轉(zhuǎn)基因小鼠[C57BL/6-Tg (Thy1-APPSwDutIowa)BW-evn/J]由購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室的2對(duì)種鼠在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。野生型C57BL/6小鼠由購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的4對(duì)種鼠在相同環(huán)境傳代繁殖。至本實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，Tg-SwDI小鼠與WT C57BL/6小鼠均在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖傳代超過(guò)5代，飼養(yǎng)環(huán)境保持12∶12 h的晝夜節(jié)律，溫度保持（22±2）℃，空氣濕度約50%～60%，動(dòng)物飼養(yǎng)于含刨花墊料的（28× 12×16）cm3的標(biāo)準(zhǔn)樹(shù)脂鼠籠中，足量自由攝取水和飼料。動(dòng)物飼養(yǎng)及所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 分組 將小鼠按基因（Tg-SwDI和WT）和年齡（2～4月齡、10～12月齡、18～20月齡）分為6組，每組21～28只，見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組

1.2.2 群體筑巢實(shí)驗(yàn) 利用固有筑巢材料在群養(yǎng)小鼠家籠中進(jìn)行，每籠有相同基因型、相同年齡與性別小鼠3～5只，每組5～7籠。實(shí)驗(yàn)第1天更換墊料，每籠放入刨花墊料均勻鋪開(kāi)，厚度1 cm，讓小鼠適應(yīng)24 h后，在第2天夜節(jié)律前2 h再均勻加入體積為（750±50）mL的刨花墊料，第3天（18 h后）觀察筑巢情況。按照4分法對(duì)筑巢質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分：1分，沒(méi)有可見(jiàn)的巢；2分，較淺的巢，巢呈碟狀，可有缺口；3分，中等的巢，巢呈碗狀，無(wú)缺口，但高度小于小鼠的臥高；4分，很好的巢，巢呈杯狀，巢的外壁明顯高于巢外墊料，高度達(dá)到或超過(guò)小鼠的臥高。并觀察每籠中小鼠糞便的分布情況。所有小鼠由同一觀察者評(píng)分，評(píng)分時(shí)不知道小鼠的基因和年齡信息（盲法評(píng)分）。

1.2.3 個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn) 小鼠完成群體筑巢實(shí)驗(yàn)3 d后進(jìn)行個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)。將上述群養(yǎng)的各組小鼠分成單籠（每籠1只），讓其適應(yīng)單籠環(huán)境48 h后，在每籠中換入厚度1 cm的刨花墊料，夜節(jié)律前2 h均勻平鋪放入剪裁大小一致的正方形無(wú)味薄紙巾片16張（邊長(zhǎng)4.5 cm），18 h后按照根據(jù)文獻(xiàn)[5]改良的4分法對(duì)筑巢質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分：1分，紙片雜亂的散布在籠子各處，沒(méi)有被撕咬；2分，紙片被聚到籠子的一側(cè)，但較松散，沒(méi)有成型的巢，沒(méi)有明顯的撕咬或折疊；3分，紙片聚攏折疊呈成型但較平的巢，沒(méi)有明顯的撕咬；4分，紙片聚攏折疊成較深的巢，并被撕咬成小塊，見(jiàn)圖1。所有小鼠均采用盲法評(píng)分。

圖1 紙巾個(gè)體筑巢評(píng)分方法（4分法）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與圖表繪制，結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，雙因素方差分析年齡與基因因素對(duì)筑巢行為的影響，組間兩兩比較采用事后檢定，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 群體筑巢實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基因型（F1,31=37.03，＜0.0001）和年齡（F2,31=3.88，＜0.05）對(duì)群體筑巢評(píng)分均有影響，見(jiàn)圖2A。Tg-SwDI小鼠與WT小鼠相比，各年齡組均有群體筑巢功能的下降。而基因型和年齡這兩個(gè)因素之間的相互作用對(duì) 筑巢 評(píng) 分 無(wú)顯 著 影 響（F2,31=0.07，＝0.93）。此外，WT小鼠的糞便多位于所筑巢的遠(yuǎn)端，巢內(nèi)很少有糞便；而Tg-SwDI小鼠糞便則分布散亂，尤以18～20月齡為甚。

2.2 個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與WT小鼠相比，在2～4月齡和10～12月齡，Tg-SwDI小鼠的個(gè)體筑巢功能下降均不明顯，18～20月齡才有顯著變化，見(jiàn)圖2B。但雙因素方差分析仍提示顯著的基因（F1,135=23.64，＜ 0.0001） 和年 齡（F2,135=15.46，＜0.0001）差異，二者相互作用的影響則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F2,135=1.32，＝0.27），見(jiàn)圖2。

圖2 各組群體筑巢（A）及個(gè)體筑巢（B）評(píng)分比較

3 討論

基于AD和CAA發(fā)病機(jī)制的β淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）毒性學(xué)說(shuō)，產(chǎn)生了許多不同的異常表達(dá)Aβ的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型（主要是小鼠模型），這些模型一方面可部分模擬人類(lèi)AD的病理表現(xiàn)，另一方面可部分模擬AD患者可能出現(xiàn)的行為異常，一個(gè)成功的AD小鼠模型二者缺一不可。這些動(dòng)物模型及相應(yīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的出現(xiàn)為人類(lèi)探索AD等疾病的病因及其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診療手段提供了非常重要的研究途徑。

筑巢是小鼠常見(jiàn)的日常行為，與母性行為、社交行為、體溫保持等因素有關(guān)[4]。關(guān)于AD轉(zhuǎn)基因小鼠筑巢行為的研究并不多，以個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)為主，且不同研究結(jié)果存在不一致性。有研究發(fā)現(xiàn)APPswe/PS1A246E雙轉(zhuǎn)小鼠6月齡即出現(xiàn)筑巢功能受損[7]。在Tg-2576小鼠，有文獻(xiàn)報(bào)道2～3月齡即可出現(xiàn)個(gè)體筑巢功能的下降且隨年齡增加而加重[8]。但較早的報(bào)道卻發(fā)現(xiàn)這種小鼠只有群體筑巢功能的下降而個(gè)體筑巢功能不受影響[4]。本研究在Tg-SwDI小鼠觀察到的現(xiàn)象與之相似：這種小鼠早期即可出現(xiàn)群體筑巢功能下降，但個(gè)體筑巢功能直到18～20月齡才出現(xiàn)明顯下降，提示兩種筑巢行為可能受不同因素影響，而影響個(gè)體筑巢功能的因素可能更為復(fù)雜。

群體筑巢可能更多地受社交行為的影響。當(dāng)群居時(shí)，小鼠抱團(tuán)睡覺(jué)，可以使體溫喪失降低到最小程度。這種抱團(tuán)行為屬于社交行為，對(duì)環(huán)境的變化很敏感[4]。此前有文獻(xiàn)報(bào)道在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型可出現(xiàn)攻擊性增強(qiáng)[9]，筆者也觀察到某些雄性Tg-SwDI小鼠與WT小鼠相比具有更強(qiáng)的攻擊性，而這種同籠群養(yǎng)小鼠之間的攻擊行為顯然可能會(huì)影響群體筑巢中的協(xié)作。攻擊性增強(qiáng)和社交行為異常在臨床上均是AD患者的較常見(jiàn)癥狀[10]，群體筑巢實(shí)驗(yàn)似乎可以較好地模擬這類(lèi)癥狀。但目前群體筑巢實(shí)驗(yàn)多用于自閉癥等精神疾病模型的研究[11]，在AD模型中的研究報(bào)道屈指可數(shù)，其機(jī)制和意義還需更多研究來(lái)闡明。

個(gè)體筑巢行為可能主要反映小鼠日?；顒?dòng)的執(zhí)行能力[12]。既然筑巢的一個(gè)主要?jiǎng)訖C(jī)是保持體溫，由于個(gè)體筑巢實(shí)驗(yàn)環(huán)境下無(wú)法再“抱團(tuán)取暖”，體溫丟失更快，因此，這種情況下小鼠具有更強(qiáng)烈的筑巢動(dòng)機(jī)，除非執(zhí)行功能下降導(dǎo)致無(wú)法完成筑巢。小鼠筑巢行為的生物學(xué)基礎(chǔ)較復(fù)雜，可能受到多個(gè)腦區(qū)和神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)的控制。目前認(rèn)為AD模型鼠的筑巢功能下降可能與Aβ對(duì)相關(guān)功能腦區(qū)的神經(jīng)毒性有關(guān)，有些AD小鼠在出現(xiàn)老年斑之前便有個(gè)體筑巢功能的下降，提示可溶性Aβ的毒性可造成筑巢損害[8]；但本實(shí)驗(yàn)在Tg-SwDI小鼠所見(jiàn)以及其他一些研究的結(jié)果[4]卻發(fā)現(xiàn)個(gè)體筑巢功能的下降出現(xiàn)較晚，即在出現(xiàn)大量老年斑后才出現(xiàn)筑巢損害。而此前在3xTgAD小鼠還觀察到用棉花作為筑巢材料時(shí)，其與WT小鼠無(wú)差異[12]，而用紙巾筑巢時(shí)可觀察到筑巢行為延遲，提示筑巢材料的偏好和難易程度也可能影響筑巢結(jié)果。目前，針對(duì)不同AD模型甚至相同模型的研究結(jié)論不盡相同，可能與實(shí)驗(yàn)方法、模型的基因背景和病理特點(diǎn)、動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境等諸多因素相關(guān)，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究揭示。

目前針對(duì)AD模型小鼠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)多集中在空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的認(rèn)知功能方面，而關(guān)注其日常活動(dòng)和執(zhí)行功能的實(shí)驗(yàn)很少，筑巢實(shí)驗(yàn)無(wú)疑是一個(gè)很好的選擇。筑巢一方面有助于研究AD患者發(fā)生日?；顒?dòng)和執(zhí)行功能下降的病理生理機(jī)制，另一方面為利用動(dòng)物模型研究AD的藥物及康復(fù)治療手段提供了良好的行為學(xué)評(píng)價(jià)工具。目前已有研究發(fā)現(xiàn)一些治療AD的候選藥物，在減少AD模型鼠Aβ沉積的同時(shí)可以改善筑巢行為[13,14]。由于近年來(lái)認(rèn)知康復(fù)鍛煉等非藥物干預(yù)方法在AD治療中的應(yīng)用越來(lái)越引起重視，因此，筑巢實(shí)驗(yàn)在利用動(dòng)物模型評(píng)估豐富環(huán)境等康復(fù)訓(xùn)練相關(guān)療法的研究中也將有較廣泛的應(yīng)用前景[15]。有研究發(fā)現(xiàn)剝奪小鼠的筑巢材料會(huì)增加其應(yīng)激反應(yīng)水平[8]，而相反在群養(yǎng)雄性小鼠籠中放入棉塊（筑巢材料）可降低其攻擊性[4]。那么給AD動(dòng)物模型早期提供棉塊、紙巾等筑巢材料是否可作為一種功能鍛煉方法延緩其執(zhí)行功能的下降？或者提供筑巢材料可否作為豐富環(huán)境的一部分加強(qiáng)其效果？如何有意識(shí)地訓(xùn)練AD患者鋪床、疊被或其他日常行為從而對(duì)延緩其病情進(jìn)展產(chǎn)生幫助？另一方面，AD相關(guān)動(dòng)物模型產(chǎn)生筑巢行為損害的病理生理機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明；動(dòng)物筑巢行為模擬AD患者日常行為能力的效度也有待進(jìn)一步評(píng)估。因此，圍繞AD動(dòng)物模型和筑巢行為研究還有很多工作可做。

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Impairment of Nesting Behavior in Tg-SwDI Mice

Objective:To investigate the differences in the nesting behaviour between Tg-SwDI transgenic mice and wild-type(WT)mice.Methods:Transgenic Tg-SwDI(Tg)and wild-type(WT)mice have been studied to observe their group nest-building behaviors with chip shavings and individual nest-building behaviors with paper towels.Results:The genotype（F1,31=37.03，＜0.0001）and age（F2,31=3.88，＜0.05）had effect on the group nest construction,and the same on the individual nest-building.However,there were no significant differences between Tg and WT mice until 18～20 months.Conclusion:The Tg-SwDI transgenic mice showed a worse nesting compared to WT mice at the early ages when they were group-housed.Most individually housed mice in each group showed impaired nesting behavior in old age(18～20 months).

Alzheimer disease;Tg-SwDI mice;nesting behavior

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.01.001

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430030

2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州450052

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81271407）

2013-08-30

張?zhí)K明Suming_zhang@163. com