甘受益，李彩蓉，2＊＊，曾令勇，黃紅霞，鎮(zhèn)海濤，2，馮光瑞

(1.咸寧市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院)

急性心肌缺血是指急性冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷所致的心肌局部缺血性壞死，藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)及冠脈搭橋術(shù)等方法可及時(shí)恢復(fù)血供，改善心肌缺血。但研究［1］也發(fā)現(xiàn)恢復(fù)心肌血供在短時(shí)間內(nèi)可加重原有的缺血性心肌損傷，還可導(dǎo)致心律失常、心力衰竭等更嚴(yán)重的損傷，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。尋找減輕MIRI 的藥物對(duì)治療急性心肌缺血、提高預(yù)后具有重要的意義。SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)是一種具有NAD2依賴(lài)的蛋白去乙?；富钚缘亩喙δ苻D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)參與調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞壽命的不同信號(hào)通路、糖代謝及胰島素分泌等。最近研究［2］發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1 可加重小鼠心肌缺血再灌注損傷，提示SIRT1 在心肌損傷中起重要作用。中藥何首烏屬是多年生落葉藤本蓼科藥用植物，具有多種保健和醫(yī)藥功能，二苯乙烯苷(TSG)是其最主要的活性成分之一，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)［3，4］，并且是SIRT1 最重要的激活劑之一，提示TSG 可能通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1 從而對(duì)MIRI 有防治作用。本研究采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立MIRI 模型，再灌注前預(yù)先給予TSG，觀察其是否通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1 從而對(duì)抗MIRI。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

TSG(北京中國(guó)藥品生物制品鑒定所，純度98%，批號(hào)Z080912-3)，SOD、GSH-Px 和MDA 測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);SIRT1、βactin 抗體(Santa Crtz，USA)。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)近交系雄性SD 大鼠(由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(220 ±14)g，每籠5 只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12h 光照周期。

1.3 儀器

DH2140B 型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器廠);RM6240 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的制備與處理

大鼠腹腔注射10%烏拉坦(4ml/kg)麻醉，氣管切開(kāi)并使用呼吸機(jī)通氣。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，連接至RM6240 生物信號(hào)處理系統(tǒng)，記錄左心室內(nèi)壓(LVSP)、左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)以及左心室舒張末期壓力(LVEDP)，并同時(shí)記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。暴露心臟，用穿有聚氯乙烯管的手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎30 min 后恢復(fù)血流灌注120 min 后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。結(jié)扎后心電圖出現(xiàn)ST 段抬高、QRS 波增寬或振幅加大表示模型成功。給藥方式為結(jié)扎30min 后恢復(fù)血流前舌下靜脈注射。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+TSG(10mg/kg)組及缺血再灌注+TSG(20mg/kg)組。

1.4.2 心肌組織組織病理學(xué)檢測(cè)

福爾馬林固定心臟，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察心肌的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性、丙二醛(MDA)含量測(cè)定

操作按試劑盒(南京建成)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.4 心肌組織SIRT1 表達(dá)檢測(cè)

提取心肌總蛋白，以Western Blot 檢測(cè)SIRT1表達(dá)，顯影條帶用圖像分析系統(tǒng)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TSG 對(duì)缺血再灌注大鼠心功能的影響

缺血再灌注120 min 后大鼠LVSP 及±dp/dtmax 逐漸下降，而LVEDP 則進(jìn)行性增加，表明大鼠心功能明顯受損。TSG 治療組與缺血再灌注組相比，大鼠LVSP 及±dp/dtmax 均有相應(yīng)增加，而LVEDP 明顯降低，表明TSG 對(duì)缺血再灌注所致的心功能損害具有一定防治作用，見(jiàn)表1。

表1 TSG 對(duì)大鼠心功能的影響(，n=10)

表1 TSG 對(duì)大鼠心功能的影響(，n=10)

與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01

2.2 TSG 對(duì)缺血再灌注大鼠心肌形態(tài)學(xué)的影響

HE 染色光鏡下顯示假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列規(guī)整，染色均勻，胞核清晰可見(jiàn)，無(wú)炎性反應(yīng)，缺血再灌注120 min 后心肌細(xì)胞排列混亂，染色深淺不一，心肌纖維萎縮，局部有灶性溶解壞死，間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);TSG 治療組心肌細(xì)胞排列較整齊，胞核較清晰，胞漿有部分空泡樣變性，間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞，以大劑量TSG 治療組效果更明顯。

2.3 TSG 對(duì)缺血再灌注大鼠心肌SOD 和GSH 的活性、MDA 含量的影響

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注大鼠心臟組織均漿中SOD 和GSH 活性明顯降低(P ＜0.01)，MDA 含量顯著上升(P ＜0.01)。TSG 治療組能夠增加心臟組織SOD 和GSH 活性，并且減少M(fèi)DA的生成。提示TSG 可通過(guò)增加心肌抗氧化酶的活性及抑制心臟過(guò)度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而起到心臟保護(hù)作用，見(jiàn)表2。

表2 TSG 對(duì)心肌組織SOD 和GSH-Px 的活性、MDA 含量的影響(，n=10)

表2 TSG 對(duì)心肌組織SOD 和GSH-Px 的活性、MDA 含量的影響(，n=10)

與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P ＜0.05

2.4 TSG 對(duì)缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達(dá)下降，與假手術(shù)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，TSG 治療后心肌組織SIRT1 蛋白表達(dá)量上升，提示TSG 可能通過(guò)上調(diào)心臟SIRT1 蛋白水平而對(duì)心肌再灌注損傷有防治作用，見(jiàn)圖1。

圖1 TSG 對(duì)缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達(dá)的影響

3 討論

心肌血液供應(yīng)以及新陳代謝是保證心臟正常功能的重要條件，心肌缺氧缺血會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)性損傷，及時(shí)恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)是治療急性心肌缺血的重要原則。但大多數(shù)情況下心肌缺血再灌注后都會(huì)有一定的損傷，出現(xiàn)明顯的功能障礙。我們采用手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后再松開(kāi)的方式復(fù)制臨床上常見(jiàn)的心肌缺血再灌注損傷的模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注120 min 后大鼠心功能明顯受損;心肌細(xì)胞排列混亂，染色深淺不一，心肌纖維萎縮，局部有灶性溶解壞死，間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TSG 治療組結(jié)果顯示TSG 能增加LVSP 及±dp/dtmax 及減少LVEDP，并且心肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改善，提示TSG 能防治缺血再灌注引起的心功能損害及心肌組織損傷。

目前研究認(rèn)為缺血再灌注損傷的主要機(jī)理是細(xì)胞內(nèi)的鈣超載及氧自由基的產(chǎn)生增多所致。心肌缺血再灌注時(shí)，線(xiàn)粒體功能障礙，氧化酶活性降低，同時(shí)SOD、GSH 等還原酶的活性降低，清除活性氧的能力減弱，產(chǎn)生大量氧自由基。增加的氧自由基與細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使得其過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量增多，MDA 能破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞損傷。我們的結(jié)果顯示TSG 可增加心臟組織SOD 和GSH-Px 活性，并且減少M(fèi)DA 的生成，提示TSG 可通過(guò)增加心肌抗氧化酶的活性及抑制心臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而起到心臟保護(hù)作用。

SIRT1 在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，在機(jī)體的能量調(diào)控中起重要作用［5］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)TSG 能夠通過(guò)上調(diào)腎臟SIRT1 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)腎臟抗氧化能力而對(duì)糖尿病腎病有防治作用［6］，最近有研究發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1 可加重小鼠心肌缺血再灌注損傷［2］。我們的實(shí)驗(yàn)顯示缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達(dá)明顯下降，TSG 治療組心肌組織SIRT1 表達(dá)明顯上升，由于SIRT1 在能量調(diào)控中起重要作用，提示TSG 可能通過(guò)上調(diào)心臟SIRT1蛋白水平增強(qiáng)心肌的抗氧化能力而對(duì)心肌再灌注損傷有防治作用。

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