朱靜芬 劉 光 江 淼 郭 亮 洪若瑜 顧宏偉 李勇剛

腫瘤基因治療由于受到安全性及轉(zhuǎn)染效率等因素的影響，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[1-2]。近年來，高分子基因載體由于具有更好的安全性、穩(wěn)定性、低成本及合成方便等特點(diǎn)而備受關(guān)注。迄今已構(gòu)建了不同的載體形式，其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率也不斷提高[3-5]。磁性納米顆粒具有良好的磁學(xué)性能，已廣泛應(yīng)用于體內(nèi)、外藥物釋放及MRI監(jiān)測[6-7]。本研究采用陽離子高分子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）修飾超順磁性氧化鐵納米顆粒，構(gòu)建磁性高分子基因載體(PEIMNPs)，探討其用于磁性基因轉(zhuǎn)染及在體MRI監(jiān)測的可行性與效果。

方 法

1. 材料

葡聚糖T20(MW≈20000）購自SCRC公司；聚乙烯亞胺(PEI，支MW≈25 000 g/mol）購自Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒DNA購自上海生工生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基：營養(yǎng)混合液F-12(DMEM）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4）、0.05%胰蛋白酶-EDTA均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。人肝癌Bel7402細(xì)胞從中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海，中國）獲得。

2. 磁性高分子基因載體 (DNA-MNPs）的合成

2.1 PEI修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(PEIMNPs)的合成：根據(jù)本課題組前期研究報道，合成葡聚糖-超順磁性Fe3O4納米顆粒（SPIO）[2-3]。通過葡聚糖-超順磁性Fe3O4納米顆粒表面的葡聚糖與一氯乙酸經(jīng)過羧甲基化反應(yīng)生成羧甲基葡聚糖改性的超順磁性Fe3O4納米顆粒(CMD-MNPs)。支化聚乙烯亞胺(bPEI)與CMD-MNPs表面的羧基通過DCC/NHS進(jìn)行化學(xué)連接，得到PEI-MNPs。PEI：Fe3O4重量比分別為0.1、0.5、1、2、3。

2.2 氧化鐵-質(zhì)粒DNA磁性納米顆粒（DNAMNPs）基因載體的合成：DNA-MNPs的合成按照最佳預(yù)設(shè)比值，將PEI-MNPs (50μg/ml)與溶于PBS中的裸DNA (50μg/ml) 等體積混合并反應(yīng)30分鐘。DNA終濃度100μg/ml。

3. CMD-MNPs 與DNA-MNPs的物理特性檢查

采用透射型電子顯微鏡(HitachiH-600-II) 觀察CMD-MNPs 與DNA-MNPs聚合體的形態(tài)。PEI-MNPs的平均流體力學(xué)直徑測量采用Malvern HPPS5001型粒徑測試儀通過動態(tài)光散射(DLS）原理在25℃時測定，PEI-MNPs懸浮液終濃度為0.1mg/ml。采用振動樣品磁強(qiáng)計檢測PEI-MNPs的飽和磁化強(qiáng)度。采用納米激光粒度儀Zetasizer Nano-ZS(馬爾文儀器公司)，背散射法測量DNA-MNPs粒子的Zeta電位。

4. 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗

4.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌Bel7402細(xì)胞采用10%牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中?；蜣D(zhuǎn)染前一天，將1ml細(xì)胞懸液以5×104個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種到24孔板中。細(xì)胞克隆率為60%時，行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗。

4.2 基因轉(zhuǎn)染：人肝癌Bel7402細(xì)胞分為磁性轉(zhuǎn)染組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組，兩組每孔細(xì)胞中加入100ml DNAMNPs基因載體溶液(1mg DNA /孔)。磁性轉(zhuǎn)染組在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞下放置高強(qiáng)度磁鐵行24h磁性轉(zhuǎn)染。 常規(guī)轉(zhuǎn)染組不放置磁鐵，行24h常規(guī)轉(zhuǎn)染作為對照。在磁性轉(zhuǎn)染和常規(guī)轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞洗滌至少三次，以除去懸液中剩余的基因載體，更換細(xì)胞培養(yǎng)基后放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。然后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS洗滌一次，采用熒光顯微鏡觀察各組綠色熒光蛋白表達(dá)。

5. MRI檢查

取兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度1×106）1ml置于1.5mlEP管內(nèi)，分別于轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后1h及24h行MRI掃描。MRI掃描采用3.0T的全身掃描儀(GE HD MRI）進(jìn)行掃描，掃描序列及參數(shù)如下：①FSET2WI采用序列，TR/ TE：2500/80ms，層厚/間距：2.0/0.5mm，F(xiàn)OV 10 cm×10 cm，矩陣：224×192，激勵次數(shù)4 NEX。②T2map序列，使用8個回波, 其TE分別為5、10、20、40、60、80、100及120ms，TR為2000ms，其他參數(shù)同F(xiàn)SE-T2WI序列。

多回波SE T2map序列掃描完成后，圖像傳至AW4.0工作站，使用T2map測量軟件，測量各組不同時間點(diǎn)T2弛豫時間。T2弛豫時間的擬合公式y(tǒng)=A+C*exp(-t/T2)，其中y是時間為t時測量的信號強(qiáng)度，A是背景噪聲，C*是質(zhì)子密度信號強(qiáng)度，t是回波時間。T2弛豫率的計算R2=1/T2（ s-1）。

結(jié) 果

1. CMD-MNPs 與DNA-MNPs的物理特性

1.1 形態(tài)與粒徑：PEI-MNPs 與 DNA-MNPs復(fù)合物透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，PEI-MNPs 在溶液中為球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑為15nm，分散均勻，未看到細(xì)胞集聚現(xiàn)象（圖1A）。DNA-MNPs的形態(tài)如（圖1B）所示，質(zhì)粒DNA通過靜電相互作用而吸附于PEI-MNPs表面，DNA-MNPs聚合體的平均粒徑約850nm。

在2.0∽11.0的pH范圍內(nèi)和0∽0.14mol/L的NaCl濃度范圍內(nèi)PEI-MNPs的平均流體微粒直徑在35∽45nm之間（圖2、3），在所測試的離子強(qiáng)度變化范圍與pH變化范圍內(nèi)沒有觀察到粒子的聚集。

圖1 A.PEI-MNPs 聚合物的透射電子顯微鏡圖，PEIMNPs為球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑為15nm，分散均勻，未看到細(xì)胞集聚現(xiàn)象。B. DNA-MNPs 聚合物的透射電子顯微鏡圖。

圖2 不同PEI/ Fe3O4重量比下的PEI-MNPs在不同NaCl濃度下的流體微粒直徑，其中NaCl濃度范圍為0∽0.14mol/L，PEI/ Fe3O4比值在2:1,1:1,0.5:1時流體微粒直徑均在35∽45nm之間。

圖3 不同PEI/ Fe3O4重量比下的PEI-MNPs在不同pH下的流體微粒直徑，其中pH在2.0∽11.0范圍內(nèi)，PEI/ Fe3O4比值在2:1,1:1,0.5:1時流體微粒直徑均在35∽45nm之間。

圖4 PEI-MNPs的飽和磁化強(qiáng)度曲線。

圖5 CMD-MNPs 和 PEIMNPs在不同pH的Zeta電位變化曲線。

1.2 磁學(xué)特性：PEI-MNPs在室溫下典型的樣品磁化曲線，表現(xiàn)出典型的超順磁性行為，樣品的飽和磁化強(qiáng)度(Ms）為25.8emu/g（圖4）。磁滯曲線表明大部分的納米顆粒飽和磁化強(qiáng)度約為2000Oe。

1.3 Zeta電位：CMD-MNPs和PEI-MNPs在2.0∽11.0的pH范圍內(nèi)的Zeta電位曲線表明隨著溶液堿性逐漸增加，CMD-MNPs的Zeta電位在2.0∽11.0的pH范圍內(nèi)負(fù)電位值逐漸增加，而PEI-MNPs的Zeta電位在2.0∽11.0的pH范圍內(nèi)正電位值逐漸減少（圖5）。CMD-MNPs的等電點(diǎn)為pH=2.0，PEI-MNPs的等電點(diǎn)為 pH=11.0。DNA-MNPs的Zeta電位與PEIMNPs的Zeta電位相比顯著下降（圖6）。DNA-MNPs的Zeta電位隨著Fe/DNA比值的增高而增高。在Fe/DNA=0.1時Zeta電位為-12mV，F(xiàn)e/DNA=3時Zeta電位為23mV。

2. 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染與MRI成像

磁性轉(zhuǎn)染組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組隨著轉(zhuǎn)染時間的延長T2信號強(qiáng)度減低（圖7），不同時間點(diǎn)T2值與R2值測量結(jié)果見表 1。

表1 磁性轉(zhuǎn)染組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組不同時間點(diǎn)T2值與R2值測量結(jié)果

常規(guī)轉(zhuǎn)染組與磁性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后72h的Bel7402細(xì)胞熒光顯微鏡圖顯示，在MNP與DNA比值相同的條件下，磁性轉(zhuǎn)染組的綠色熒光點(diǎn)密度顯著高于常規(guī)轉(zhuǎn)染組（圖8）。

圖6 不同PEI 與DNA重量比下PEI-MNPs 和 DNA-MNPs的Zeta電位，PEI-MNPs 和 DNA-MNPs溶解于pH = 7.0的水溶液中。

圖7磁性轉(zhuǎn)染組（A）與常規(guī)轉(zhuǎn)染組（B）轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后1小時及24小時的Bel7402細(xì)胞懸液T2WI圖。

圖8 A、C.分別為磁性轉(zhuǎn)染組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后的Bel7402細(xì)胞顯微鏡圖。B、D.分別為磁性轉(zhuǎn)染組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后的Bel7402細(xì)胞共聚焦熒光顯微鏡圖，磁性轉(zhuǎn)染組的綠色熒光點(diǎn)密度及強(qiáng)度顯著高于常規(guī)轉(zhuǎn)染組。

討 論

基因轉(zhuǎn)染載體大致可分為病毒性基因轉(zhuǎn)染載體與非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體。病毒性基因轉(zhuǎn)染載體被認(rèn)為是最有效的基因轉(zhuǎn)染載體，其轉(zhuǎn)染效率大于90%[8]。但是其安全性成為制約其在臨床應(yīng)用的主要因素[1-2]。非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體不但具有更好的安全性[3]、穩(wěn)定性[4]，且其成本低、合成方便，使其在過去幾年里備受關(guān)注。迄今已構(gòu)建了不同的載體形式，包括用脂質(zhì)、高分子聚合物或蛋白質(zhì)修飾的非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體，其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率也不斷提高[5,9]。

近年來 ，超順磁性納米顆粒作為基因載體用于磁性轉(zhuǎn)染引起了廣泛的關(guān)注。在磁場中，氧化鐵-質(zhì)粒DNA磁性納米顆粒能夠在細(xì)胞內(nèi)迅速沉降[9-11]。除此之外，磁場還有助于納米顆粒在體內(nèi)定位特定靶點(diǎn)并增加其在靶點(diǎn)的停留時間。Plank已經(jīng)證明了在靜態(tài)磁場中，利用磁性納米顆粒進(jìn)行磁性轉(zhuǎn)染能夠提高基因轉(zhuǎn)染的效率[12]。氧化鐵納米顆粒由分散狀態(tài)轉(zhuǎn)換成聚合狀態(tài)時其T2弛豫率會發(fā)生變化，這種效應(yīng)被稱為“T2弛豫開關(guān)效應(yīng)”。氧化鐵納米顆粒的T2弛豫變化與許多因素密切相關(guān)，包括粒徑、表面電荷、表面功能基團(tuán)及表面結(jié)合水的含量，氧化鐵由分散變成聚合狀態(tài)既可以導(dǎo)致T2弛豫率的增加，也可使其減小，主要取決于上述這些因素的變化[13]。目前，已有研究者嘗試將基于“T2弛豫開關(guān)效應(yīng)”的MR成像用于藥物與基因釋放的監(jiān)測，取得初步成功[13-14]。本研究采用超微超順磁性氧化鐵（USPIO）構(gòu)建磁性納米基因載體PEI-USPIO，用于磁性基因轉(zhuǎn)染與基因釋放的MRI監(jiān)測。結(jié)果表明，在磁性轉(zhuǎn)染組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，其T2弛豫率減小，這表明DNA-MNPs顆粒成功地轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并隨著時間推移逐步釋放質(zhì)粒DNA，基因釋放前后USPIO由聚合變成分散狀態(tài)時T2弛豫發(fā)生了顯著的變化。與常規(guī)轉(zhuǎn)染組相比，磁性轉(zhuǎn)染組的T2弛豫縮短更快更顯著，綠色熒光蛋白表達(dá)檢測也表明磁性轉(zhuǎn)染組綠色熒光蛋白表達(dá)顯著高于常規(guī)轉(zhuǎn)染組，說明磁性基因轉(zhuǎn)染能顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率。同時，此種MRI監(jiān)測方法有望用于基因載體體內(nèi)作用機(jī)制、藥代動力學(xué)以及基因治療療效的評估。

聚乙烯亞胺 (PEI) 是基因載體中一種較為理想的陽離子聚合物[8]，經(jīng)PEI修飾的氧化鐵-質(zhì)粒DNA磁性納米顆粒(PEI-MNPs)能夠逃脫內(nèi)涵體的吞噬清除。PEI的的轉(zhuǎn)染效率及其毒性與它的分子量大小緊密相關(guān)[15]。高分子量的PEI有較高的轉(zhuǎn)染效率但急性細(xì)胞毒作用較明顯，而低分子量的PEI經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)試驗被證明是無毒的，但是僅有很低的轉(zhuǎn)染效率。本研究采用分子量為25000的PEI成功合成了磁性納米載體(PEI-MNPs)，并結(jié)合質(zhì)粒DNA，構(gòu)建氧化鐵-質(zhì)粒DNA磁性納米顆粒(DNA-MNPs）。PEI-MNPs在生理pH范圍內(nèi)帶正電荷并呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。DNAMNPs在磁場內(nèi)呈現(xiàn)出較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與基因表達(dá)效能，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞未出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性效應(yīng)。

綜上，本研究在超順磁性氧化鐵納米顆粒表面包被聚乙烯亞胺(PEI-MNPs)并結(jié)合質(zhì)粒DNA，成功構(gòu)建了氧化鐵-質(zhì)粒DNA磁性納米顆粒聚合物(DNAMNPs）。PEI-MNPs聚合物表現(xiàn)出了典型的超順磁性行為，并在較大的pH變化范圍內(nèi)和NaCl濃度變化范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。磁共振成像能監(jiān)測細(xì)胞對DNA-MNPs的攝取以及細(xì)胞內(nèi)基因釋放過程。在外磁場導(dǎo)引下行磁性基因轉(zhuǎn)染其轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)效率顯著高于常規(guī)轉(zhuǎn)染。

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