周 璇 王云玲 王 紅 劉曉晨 馬景旭 賈文霄

肺外結(jié)核中最常見的骨關(guān)節(jié)結(jié)核是脊柱結(jié)核,約占骨結(jié)核的50%[1],因而建立脊柱結(jié)核動(dòng)物模型，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究是脊柱結(jié)核防治工作中不可缺少的[2]。常規(guī)MRI檢查不僅可以發(fā)現(xiàn)椎體及軟組織改變，還可以更準(zhǔn)確地顯示病變累及椎管內(nèi)的程度[3]，其中磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）可以從分子水平定量角度對(duì)疾病診斷提供一定信息，而感興趣區(qū)(region of interest,ROI）的設(shè)置是DWI圖像中ADC值測(cè)量比較關(guān)鍵的基礎(chǔ)步驟之一，目前臨床和文獻(xiàn)中ROI的選取多數(shù)不描述其選取標(biāo)準(zhǔn)[4]，本文利用多b值DWI掃描觀察ADC值的變化并擬合ADC圖，并采用兩種不同的ROI設(shè)置方法測(cè)量脊柱結(jié)核的ADC值，以探討合適的b值及ROI設(shè)置方法對(duì)診斷脊柱結(jié)核的早期敏感性提供必要的依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)材料及分組

選取兔齡24周、健康的成年新西蘭大白兔55只，雌雄不限，分籠隔離飼養(yǎng)，體重3.0～3.5kg。人型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)H37Rv菌株(中國(guó)生物制品研究所)。將實(shí)驗(yàn)兔分為實(shí)驗(yàn)組(40只)和對(duì)照組(15只)，術(shù)前拍攝脊柱X線片，以證實(shí)脊柱無病變、結(jié)構(gòu)無異常。

2.造模方法

將人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株在羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增制成濃度1.0×107CFU/ml均勻的菌懸液（5.0mg/ml）。將實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（劑量為20mg/kg重量）進(jìn)行麻醉，在左側(cè)腰背部剃去兔毛后，以L5棘突向下作6cm側(cè)方路入，充分暴露L5椎體，于L5椎體上部近椎間盤處鉆出約0.3cm×0.8cm×0.4cm的骨孔，骨孔道填入浸注0.2ml結(jié)核菌懸液的明膠海綿，骨蠟封閉骨孔。對(duì)照組：麻醉及手術(shù)方法與病變組相同，不同處理為：對(duì)照組骨孔內(nèi)填塞的為浸注0.2ml生理鹽水的明膠海綿。

3.術(shù)后觀察及影像學(xué)、組織病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)

3.1 動(dòng)物一般情況：包括動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、切口情況。如動(dòng)物切口出現(xiàn)感染，立即淘汰。

3.2 MRI檢查：手術(shù)造模后第4、6、8周行MRI檢查。實(shí)驗(yàn)均使用Philips Gyroscan 1. 5T磁共振成像儀，利用8通道正交頭線圈、俯臥位、腳先進(jìn)的方式進(jìn)行，采用TFE序列進(jìn)行定位，掃描全脊柱,用SEEPR類型的擴(kuò)散加權(quán)成像法。DWI掃描參數(shù)為：TR2000ms，TE74ms，矩陣168×120，層厚1mm，層間距1mm，采集7層，NSA 8，400s/mm2，掃描時(shí)間68s。圖像處理及參數(shù)計(jì)算運(yùn)用biomap軟件，將低b值（0s/mm2、50s/mm2、100s/mm2）、高b值（600s/mm2、800s/mm2、1000s/mm2）、7個(gè)b值（b=0s/mm2、50s/mm2、100s/mm2、500s/mm2、600s/mm2、800s/mm2、1000s/mm2）、3個(gè)b值（0s/mm2、500s/mm2、1000s/mm2）分別擬合出ADClow圖、ADChigh圖、ADC7b圖、ADC3b圖進(jìn)行圖像特點(diǎn)的分析。利用ADC7b圖同樣病變區(qū)域內(nèi)選擇三個(gè)面積下ROI及單個(gè)面積ROI，兩種方法的ROI總面積一致，同時(shí)要求兩名醫(yī)師分別采用盲法進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)量ADC值，按照同樣方法測(cè)量3次，取平均值。得出ADC3b值、ADC7b值、ADClow值、ADChigh值以及ADChigh值與ADClow值之間的差異（ADCperf值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩種ROI方法選擇的ADC7b值與對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并進(jìn)行ROC曲線分析靈敏度、特異度。

3.3 組織病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)兔在造模后行MRI檢查完畢處死后切取其病變組織，將病變組織涂片后，逐步滴加石炭酸復(fù)紅適量，加熱5分鐘后，冷卻、沖洗。用3%鹽酸酒精脫色、再?zèng)_洗，再用堿性亞甲藍(lán)溶液復(fù)染，沖洗后油鏡觀察。

4.統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)分析,分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組病變椎體不同時(shí)間段ADC3b值、ADC7b值、ADClow值、ADChigh值、ADCperf值以及單個(gè)ROI和多個(gè)ROI測(cè)得的ADC值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,分別進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用受試者ROC曲線確定ADC值臨界點(diǎn)并計(jì)算靈敏度、特異度。

結(jié) 果

1.動(dòng)物術(shù)后一般情況

術(shù)中對(duì)照組麻醉死亡兩只，病變組40只大白兔經(jīng)病理學(xué)檢查，確診感染結(jié)核桿菌的為34只，其余6只未感染，淘汰，接種成功率為85%。

2.影像學(xué)表現(xiàn)

2.1 MRI檢查：手術(shù)造模后第4周實(shí)驗(yàn)組兔常規(guī)MRI平掃未見明顯異常，而在DWI圖上較其他椎體呈稍高信號(hào)（圖1A）。術(shù)后第6周實(shí)驗(yàn)組兔腰5椎體呈混雜信號(hào)，DWI圖上較正常椎體呈明顯高信號(hào)，并較第4周病變范圍增大（圖1B）。術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組兔椎體病變較前幾周范圍增大，腰大肌走行區(qū)可見片狀高信號(hào)，考慮冷膿腫形成（圖1C）。對(duì)照組術(shù)后4周、6周、8周MRI掃描椎體形態(tài)正常，兔腰背部皮下軟組織異常信號(hào)，考慮手術(shù)創(chuàng)傷引起。

（2）術(shù)后4周、6周、8周后低b值DWI圖像擬合而成ADClow圖，其值包括血流灌注及水分子彌散的雙重貢獻(xiàn)（圖2A）；ADChigh圖的b值高，背景噪聲大，圖像信噪比最差（圖2B）；ADC3b圖較ADC7b圖信噪比低（圖2C）；ADC7b信噪比最高，病變顯示最清楚（圖2D）。

2.2 ADC值的測(cè)量：①ADC3b值、ADC7b值以及ADCperf值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而ADClow值與ADChigh值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05)，第4周的ADC3b值、ADC7b值、ADCperf值分別與第6周、第8周存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.011，P=0.008；P=0.042，P=0.006；P=0.033，P=0.001）（見表1）。②單個(gè)ROI或多個(gè)ROI時(shí)病變組與對(duì)照組的ADC值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而同一病變單個(gè)ROI測(cè)得的ADC均值較多個(gè)ROI低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.610，P=0.542；t=0.841，P=0.448）。多個(gè)ROI測(cè)得的ADC值診斷脊柱結(jié)核的靈敏度、特異度高于前者（表2，圖2D）。

2.3 組織病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)組40只實(shí)驗(yàn)兔中有34只組織內(nèi)均可見灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)，骨組織和纖維結(jié)締組織內(nèi)可見結(jié)核樣肉芽腫及少量干酪樣壞死。病變椎體病理抗酸染色呈陽(yáng)性（圖3），示有膿細(xì)胞、類上皮樣細(xì)胞或壞死灶等形成。對(duì)照組骨組織內(nèi)未見異常。

表1 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間段各類ADC值的測(cè)量結(jié)果比較（±s）

表1 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間段各類ADC值的測(cè)量結(jié)果比較（±s）

時(shí)間 例數(shù) ADC7b ADC3b ADClow ADChigh ADCperf 4周 34 0.60±0. 03 1.87±0. 02 1.01±0.07 0.46±0.05 0.55±0.06 6周 34 0.62±0.04 1.75±0.03 1.02±0.05 0.42±0.07 0.60±0.06 8周 34 0.66±0.04 1.60±0.05 1.03±0.06 0.39±0.04 0.64±0.07 F值 4.213 3.254 0.230 1.995 5.294 P值 0.010 0.024 0.875 0.135 0.005

表2 兩種ROI設(shè)置方法的結(jié)果比較(±s）

表2 兩種ROI設(shè)置方法的結(jié)果比較(±s）

組別 例數(shù) 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組 t p單個(gè)ROI 34 0.62±0.04 0.71±0.03 7.301 0.000多個(gè)ROI 13 0.45±0.04 0.58±0.05 8.763 0.000

表3 兩種不同ROI選擇的ADC值的準(zhǔn)確性

討 論

目前研究通過對(duì)DWI的影像信號(hào)高低的觀察及ADC值的測(cè)量對(duì)疾病進(jìn)行分析診斷，DWI信號(hào)的衰減值受物質(zhì)的ADC值和彌散敏感系數(shù)值（bvalue,b值）這兩個(gè)因素的影響，b值越大，對(duì)擴(kuò)散的敏感性越高，所測(cè)得的ADC值越準(zhǔn)確，但是b值過大，容易導(dǎo)致圖像扭曲變形和SNR減低，反而會(huì)影響病灶A(yù)DC值的測(cè)量[5]，所以選擇適當(dāng)?shù)腷值在DWI成像方面尤為重要。ADC值可以通過ADC圖上的ROI自動(dòng)測(cè)量，也可通過像素評(píng)價(jià)測(cè)量，這些方法均取決于測(cè)量者對(duì)被測(cè)量結(jié)構(gòu)的正確識(shí)別，因?yàn)镽OI的大小、位置和數(shù)量的選擇是由操作者控制，這可能導(dǎo)致選擇性偏倚。

本研究為了保證ADC圖擬合的清晰度及ADC值測(cè)量的準(zhǔn)確性，不同ADC圖的擬合至少使用3個(gè)b值的DWI圖像，以便降低圖像的背景噪聲，增加圖像的信噪比，增加ADC值測(cè)量的精確性。目前報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)低b值（b＜200 s/mm2）圖像逐漸偏向于T2像，圖像信噪比增高，但其對(duì)組織的血液循環(huán)、血管灌注等運(yùn)動(dòng)會(huì)很大程度上影響其組織信號(hào)的衰減程度；而高b值（b＞500s/mm2）的應(yīng)用可以排除組織內(nèi)血流灌注對(duì)ADC值的影響，ADC值在反映水分子彌散運(yùn)動(dòng)變化方面越精確[6-8]，背景噪聲越大，信噪比越低，偽影增多，穩(wěn)定性較差；而ADCperf值大致反映出組織的血流灌注情況，排除水分子帶來的干擾；7b值綜合反映組織內(nèi)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)及血流灌注情況，ADC7b圖信噪比最高，獲得的ADC值越精確；3b值圖像掃描時(shí)間較短，但相對(duì)于7b值圖像的信噪比較差。本組資料中，同一病變單個(gè)ROI和多個(gè)ROI所測(cè)得的ADC值差別雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是前者都比后者低，這表明單個(gè)ROI測(cè)得的ADC值所反映的病變彌散受限程度較重。單個(gè)ROI和多個(gè)ROI所得的ADC值有差異，推測(cè)可能與病變的不均勻性及ROI內(nèi)部分容積效應(yīng)等有關(guān)，故ROI需兼顧部分容積效應(yīng)及噪聲的影響［9］。而據(jù)國(guó)內(nèi)[10]已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)表明：結(jié)核分枝桿菌侵入骨質(zhì)后4周椎體就已有充血水腫的變化，在實(shí)驗(yàn)中，考慮到由于手術(shù)創(chuàng)傷所造成的炎癥、出血及水腫，剔除了術(shù)后l周的時(shí)間點(diǎn)，在術(shù)后每周進(jìn)行病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周炎癥、出血及水腫反應(yīng)降低，軟組織損傷修復(fù)，所以將此時(shí)間點(diǎn)作為初期觀測(cè)點(diǎn)。平衡上述不同b值關(guān)系及ROI方法的選擇，7b值及3b值更能準(zhǔn)確地檢測(cè)及描述病變特征的功能性成像技術(shù)，其ADC值的變化能夠側(cè)重反映病變的某個(gè)特征，而多個(gè)ROI的選擇靈敏度及特異度更高。因此多b值的DWI聯(lián)合應(yīng)用多個(gè)ROI方法的選擇對(duì)脊柱結(jié)核尋找早期干預(yù)措施與傳染病的治療有積極作用，是應(yīng)用廣泛、實(shí)用價(jià)值大的MR功能成像技并能夠?yàn)榧怪Y(jié)核早期診斷提供一定的信息。