李 范，李 娜，陳建中，蔣小強(qiáng)，陳 怡，李 萍

1西南交通大學(xué)，成都 610031;2 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041

磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids，PLFAs)是活體生物細(xì)胞膜磷脂的重要成分，周轉(zhuǎn)速率極快且隨細(xì)胞死亡而迅速降解［1］，脂肪酸結(jié)構(gòu)與種類(lèi)多樣，對(duì)環(huán)境因素敏感，分析結(jié)果重復(fù)性較好［2］。既可用簡(jiǎn)單試劑和設(shè)備測(cè)定由PLFAs 轉(zhuǎn)化的磷酸鹽以確定微生物總量，也可以根據(jù)不同菌群的特定脂肪酸C 鏈長(zhǎng)度、飽和度及羥基等取代基位置差異研究特殊功能菌群［1］。PLFAs 的穩(wěn)定同位素分析聯(lián)用技術(shù)可用于研究復(fù)雜土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物源有機(jī)質(zhì)的代謝途徑，并識(shí)別特定微生物種群特征，可將個(gè)別微生物種群與其相應(yīng)的生物化學(xué)過(guò)程聯(lián)系起來(lái)。因此，PLFAs 在土壤微生物學(xué)研究中極具潛力，PLFAs 技術(shù)已被用于細(xì)菌純培養(yǎng)對(duì)外界脅迫的應(yīng)答、根系排泄物對(duì)根際微生物影響、養(yǎng)分對(duì)泡囊叢枝菌的影響、農(nóng)田土壤微生物區(qū)系特征以及誘導(dǎo)植物抗病性等領(lǐng)域［3］;高寒濕地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析、重金屬/有機(jī)物污染土壤植物修復(fù)、微生物對(duì)有毒底物降解過(guò)程、外加碳源利用等研究［4］。

脂肪酸分析方法在很大程度上依賴(lài)于標(biāo)記脂肪酸來(lái)確定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，因而標(biāo)記上的變動(dòng)，將導(dǎo)致群落估算上的偏差。如果脂肪酸的提取不完全，就會(huì)造成一些重要的信息丟失，所以應(yīng)運(yùn)用更好的實(shí)驗(yàn)方法盡可能地提取脂肪酸。已報(bào)道文獻(xiàn)中，大部分用于提取土壤中脂質(zhì)的方法是建立在Bligh和Dyer［5］的操作守則上的。根據(jù)這個(gè)操作方法所提取的總脂類(lèi)，只能用于表征土壤總的微生物生物量。Tunlid 等［6］進(jìn)一步發(fā)展了這個(gè)方法，通過(guò)提取和分離磷脂脂肪酸來(lái)確定土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。此后，研究方法不斷完善，但不同研究者選用的方法或多或少會(huì)有一些差異，如提取劑種類(lèi)及使用量的不同、土樣量以及提取時(shí)間的不同等。然而，只有少數(shù)的研究比較了不同提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。例如，Nielsen 和Pertersen［7］比較了提取劑(氯仿或二氯甲烷)、甲醇和緩沖液(pH7.4 的磷酸鉀或pH4.0 的檸檬酸鈉)四種不同組合方式對(duì)PLFAs 提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯仿+檸檬酸鹽緩沖液對(duì)PLFA 的提取效率最高，而二氯甲烷+磷酸鹽緩沖液的提取效率最低;同時(shí)指出，提取磷脂的顏色一般由黃色至棕色，它們主要是由腐殖酸引起的(占PLFAs 總量5%～10%)。Frosteg?rd 等［8］評(píng)價(jià)了消化時(shí)間、消化方法、儲(chǔ)存條件和提取液種類(lèi)對(duì)土壤總脂類(lèi)磷酸鹽提取的影響。然而，總脂類(lèi)磷酸鹽分析與PLFAs 分析之間存在著很大的差異。目前尚未見(jiàn)采用響應(yīng)面法超聲輔助提取磷脂脂肪酸的報(bào)道，為此，本文以森林土為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)土壤PLFAs 提取過(guò)程中超聲溫度、超聲時(shí)間及提取劑用量等因素的研究，使用響應(yīng)面法［9］優(yōu)化提取工藝，為PLFAs 技術(shù)分析復(fù)雜土壤微生物提供更精確的科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野外取樣點(diǎn)位于四川省阿壩州茂縣鳳儀鎮(zhèn)靜州村大溝的中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所茂縣山地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站(103°53'E，31°41'N)，該區(qū)域地處青藏高原東緣橫斷山系北段高山峽谷地帶的長(zhǎng)江重要支流岷江上游中部，屬暖溫帶亞高山季風(fēng)氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨。研究土壤為棕壤，植被類(lèi)型為次生灌叢。年均溫為8.9 ℃，年均降水量為919.5 mm。取土壤表層以下0～20 cm 處土壤，隨機(jī)選擇4 個(gè)點(diǎn)取土后混合作為一個(gè)土樣，過(guò)2 mm篩，去掉石塊、植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-70 ℃下冷凍保存。正己烷、正十九烷酸甲酯(色譜純，Sigma)，C9-C20 脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)112280，MIDI)，甲醇、甲苯、氯仿、丙酮、乙酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱為Agilent 19091B-102E(25 m ×0.2 mm×0.33 μm)石英毛細(xì)管柱;進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣口壓力9.77 Psi，柱溫箱溫度170 ℃，汽化室溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃。二階程序升高柱溫:170 ℃起始，5 ℃/min 室溫升至260 ℃，而后40 ℃/min 升溫至310 ℃，維持90 s;恒壓模式，尾吹氣N2(30 mL/min);進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)樣分流比100∶1。

1.3.2 超聲提取

稱(chēng)取8.0 g 凍干土(過(guò)2 mm 篩)置于特氟隆離心管中，加入21 mL 提取劑(氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液比為1∶2∶0.8)。在20 ℃下超聲提取30 min，7200 rpm 離心5 min，收集上清液。原離心管中再加入21 mL 提取液，再次超聲15 min，離心，合并上清液［5，6］。加入10 mL 檸檬酸緩沖液和10 mL 氯仿，靜置過(guò)夜，分層。移去上層液體，37 ℃水浴N2吹干。采用購(gòu)買(mǎi)的商品SPE 柱(天津艾杰爾公司)，首先用5 mL 氯仿活化柱子，然后用1 mL 甲醇轉(zhuǎn)移脂類(lèi)到SPE 柱中。再分別加入5 mL 氯仿和10 mL 丙酮洗去中性脂和醣脂，最后用5 mL 甲醇淋洗磷脂，收集淋洗液并N2吹干。依次加入1 mL 甲醇甲苯混合液(1∶1)和1 mL KOH 甲醇溶液(0.2 mol/L)，于37 ℃水浴15 min，加入2 mL 水、0.3 mL 醋酸(1 mol/L)，再用正己烷(兩次，2 mL/次)萃取磷脂脂肪酸甲酯，并N2吹干。樣品溶解于100 μL 正十九烷酸甲酯(25 mg/L，溶劑為正己烷)，轉(zhuǎn)移到色譜瓶，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 PLFAs 含量標(biāo)定與計(jì)算

PLFAs 含量標(biāo)定與計(jì)算，以正十九烷酸甲酯(C19∶0)為內(nèi)標(biāo)，利用相關(guān)因子系數(shù)進(jìn)行校正，計(jì)算土壤中的相應(yīng)磷脂脂肪酸的濃度。

式中，ax為該磷脂脂肪酸甲酯在GC 圖譜上的響應(yīng)值(即積分面積);mi為內(nèi)標(biāo)磷脂脂肪酸甲酯的含量(單位:nmol/g);ai為內(nèi)標(biāo)磷脂脂肪酸甲酯在GC 圖譜上的響應(yīng)值。

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，以出現(xiàn)2 次以上的單體PLFAs 的濃度加和，計(jì)算總PLFAs 濃度(單位:nmol/g)，視為衡量PLFAs 提取效率的參數(shù)。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

主要考察超聲溫度、超聲時(shí)間、提取劑用量等因素對(duì)森林土PLFAs 提取效率的影響;本實(shí)驗(yàn)超聲溫度選取10、15、20、25、30 ℃五個(gè)水平;超聲時(shí)間選擇10、20、30、40、60 min 五個(gè)水平;提取劑用量選擇17、19、21、23、25 mL/8 g 樣品。按單因素分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化PLFAs 提取條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、提取劑用量(C)三個(gè)因素，以總PLFAs 提取率為響應(yīng)值，選擇Box-Behnken Design 響應(yīng)面法優(yōu)化分析方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)PLFAs 提取效率的影響

固定超聲時(shí)間30 min，提取劑用量21 mL/8 g，選擇超聲溫度分別為10、15、20、25、30 ℃，按照

1.3.2 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1(A)。

由圖1 可見(jiàn)，總PLFAs 的含量隨著溫度的升高而提高，但是在25 ℃出現(xiàn)下降。溫度的升高可促進(jìn)溶液中分子的運(yùn)動(dòng)，有利于提高提取率，但由于大部分脂肪酸在20 ℃以下是穩(wěn)定的，部分脂肪酸在超過(guò)25 ℃時(shí)易揮發(fā)，造成總PLFAs 含量降低，故選擇超聲溫度為20 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)PLFAs 提取效率的影響

在超聲溫度20 ℃，提取劑用量21 mL/8 g，分別用不同的超聲時(shí)間按照1.3.2 對(duì)森林土進(jìn)行提取。提取時(shí)間對(duì)PLFAs 含量的影響如圖1(B)所示。由圖可知，隨著超聲作用時(shí)間的增加，森林土總PLFAs含量增加。但是超過(guò)40 min 后，總PLFAs 濃度有所下降，這可能是由于超聲造成溶液溫度的升高。據(jù)測(cè)量，超聲時(shí)間每增加10 min，溶液溫度上升3 ℃，超聲時(shí)間越長(zhǎng)溫度上升越高，隨著溫度的上升，造成脂肪酸中不穩(wěn)定的部分揮發(fā)損失。因此，選擇提取時(shí)間30 min 左右較為合適。

2.1.3 提取劑用量對(duì)PLFAs 提取效率的影響

在超聲溫度20 ℃，提取時(shí)間30 min，森林土8 g，分別用17、19、21、23、25 mL 提取劑按照1.3.2 進(jìn)行提取。提取劑用量對(duì)PLFAs 含量的影響如圖1(C)所示。由圖可知，隨著超聲作用時(shí)間的增加，總PLFAs含量上升;但當(dāng)提取劑用量超過(guò)21 mL 后，總PLFAs 含量變化不明顯，而且成本增加，不利于應(yīng)用于大批量生態(tài)環(huán)境樣品的處理，因此最佳提取劑用量為21 mL。

圖1 超聲溫度(A)、提取時(shí)間(B)及提取劑用量(C)對(duì)總PLFAs 得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature (A)，extraction time (B)and amount of extraction solvent (C)on extraction yield of total PLFAs

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

表1 響應(yīng)面因素水平選取表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

根據(jù)Box-Behnken Design 的原理，選取超聲溫度、超聲時(shí)間、提取劑用量作為對(duì)森林土總PLFAs含量影響的主要因素，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平見(jiàn)表1。

利用Design Expert 8.0 軟件，通過(guò)表2 中總PLFAs 含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出回歸模型方差分析表和響應(yīng)曲線(xiàn)面圖，分別見(jiàn)表3 和圖2。

表2 Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

圖2 各兩因素交互作用對(duì)總PLFAs 提取效率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of total PLFAs

由方差分析結(jié)果可知:模型的F=31.66，P ＜0.0001，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性。F失擬=3.52，失擬項(xiàng)P=0.1277 ＞0.05，失擬不顯著。模型的決定系數(shù)R2Adj=0.9452，說(shuō)明該模型能夠解釋94.52%的響應(yīng)值變化。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波輔助提取森林土中總PLFAs 的工藝條件。在總的作用因素中，回歸方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)AC、BC 均具有較高的顯著性，表明超聲溫度、超聲時(shí)間、提取劑用量以及超聲溫度與提取劑用量、超聲時(shí)間與提取劑用量的交互作用對(duì)森林土中總PLFAs 得率有較顯著影響。

通過(guò)擬合可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到森林土總PLFAs 提取效率Y 與各因素變量(A 超聲溫度，B 超聲時(shí)間，C 提取劑用量)的二次方程模型為:

Y=46.33-0.25A +0.47B +0.88C +0.58AB +1.29AC+1.12BC-2.51A2-1.24B2-1.82C2

從表3 中方差分析結(jié)果可知方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響均極顯著，說(shuō)明分析結(jié)果可靠;從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析結(jié)果可以找到它們?cè)谔崛∵^(guò)程中的交互作用，如表3 和圖2 可知超聲溫度與提取劑用量、超聲時(shí)間與提取劑用量之間的交互作用顯著，其余項(xiàng)間的交互作用不明顯。根據(jù)Design Expert 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最佳的提取條件為:超聲溫度20.47 ℃，超聲時(shí)間33.78 min，提取劑用量21.78 mL，在此條件下，預(yù)測(cè)提取總PLFAs濃度為46.5774 nmol/g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證上述模型的可信度與合理性，根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。取8 g 森林土在溫度20 ℃，提取時(shí)間30 min，提取劑用量21 mL 條件下，提取總PLFAs 濃度為45.57 nmol/g (n=3，單體PLFAs 個(gè)數(shù)35 個(gè))。

3 討論

用超聲輔助法提取森林土中總PLFAs，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取條件為:超聲溫度20 ℃，超聲時(shí)間30 min，提取劑用量21 mL/8 g 土壤樣品。在此條件下，總PLFAs 濃度為45.57 nmol/g(n=3，單體PLFAs 個(gè)數(shù)35 個(gè))。該研究結(jié)果對(duì)森林土中總磷脂脂肪酸的提取研究提供一定的參考價(jià)值，具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

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