蔡 晶，張 慶，肖 峰，遲德彪南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院;中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣州5060;南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 5055

五味子又名玄及、會(huì)及、五梅子，為木蘭科植物五味子的成熟果實(shí)。其果實(shí)有益氣生津，斂肺滋腎、止瀉澀精、安神等作用，可治久咳虛喘，津少口干，遺精久瀉，健忘失眠等癥［1，2］。五味子乙素是五味子干燥成熟果實(shí)經(jīng)有機(jī)溶劑脫脂后提取分離而得的一種藥理活性物，具有顯著的抗氧化作用［3，4］。自由基的產(chǎn)生是氧化劑發(fā)揮氧化作用的主要機(jī)制。對(duì)自由基的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，自由基蓄積的直接后果是誘發(fā)多種疾病，如腫瘤、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、心血管疾病等［5，6］，因此，人們?cè)絹碓疥P(guān)注各種自由基對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷。本研究采用了常見氧化劑H2O2對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，并以Sch B保護(hù)作為研究內(nèi)容，來考察Sch B對(duì)氧化損傷肝細(xì)胞的作用及可能的相關(guān)機(jī)制。

1 試劑與細(xì)胞

1.1 試劑

Sch B，購自中國藥品生物制品檢定所。DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司;胎牛血清，杭州市四季青生物工程材料有限公司，特級(jí);Hepes:25 g/瓶，純度99%，F(xiàn)ARCO化學(xué)品供應(yīng)公司，進(jìn)口分裝，香港;CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所(Dojindo);胰蛋白酶(美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司;人乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒、人天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)ELISA試劑盒、人丙二醛(MDA)ELISA試劑盒及人超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒，以上試劑均購自研域(上海)化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞

L02，人肝細(xì)胞株，購自上海細(xì)胞所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的作用模型的建立

參照文獻(xiàn)方法［7］，取對(duì)數(shù)生長期人肝 L02細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，將細(xì)胞懸液加入96孔和6孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞全部貼壁，供實(shí)驗(yàn)用。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

設(shè)正常對(duì)照組、H2O2模型組(H2O2終濃度為0.4 mmol/L)、五味子乙素高、中、低三個(gè)濃度組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。高、中、低濃度組分別加入H2O2(終濃度為0.4 mmol/L)和相應(yīng)濃度的Sch B(終濃度分別為 15、10、5 μmol/L)，共同培養(yǎng) 6 h 后，收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明檢測(cè)LDH、AST、MDA的水平及SOD活力，同時(shí)用CCK-8測(cè)定細(xì)胞的存活率。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Sch B對(duì)H2O2損傷肝細(xì)胞存活率的影響

加入H2O2后，在顯微鏡下觀察可見細(xì)胞減少、皺縮、細(xì)胞膜破損、結(jié)構(gòu)不清、貼壁不牢和脫落等現(xiàn)象。CCK-8檢測(cè)中，肝細(xì)胞存活率與OD值成正比。與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組OD值有顯著性差異(P＜0.01)，可使細(xì)胞存活率下降到正常組的56.8%，此結(jié)果說明0.4 mmol/L的過氧化氫對(duì)肝細(xì)胞有明顯的氧化損傷作用，這與Zhu B等報(bào)道結(jié)果接近［7］。與H2O2模型組比較，Sch B各劑量組 OD值均有升高(P＜0.01)，提示肝細(xì)胞存活率提高。這表明，Sch B對(duì)肝細(xì)胞的過氧化氫損傷具有一定的保護(hù)作用，且保護(hù)作用隨著Sch B的濃度增高而增強(qiáng)(表1)。

表1 Sch B對(duì)H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響(n=6，±s)Table 1 Protective effect of Sch B on H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

表1 Sch B對(duì)H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響(n=6，±s)Table 1 Protective effect of Sch B on H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

注:與對(duì)照組相比，aP=0.000;與模型組相比，bP=0.000。Note:Compare with control group，aP=0.000;Compare with model group，bP=0.000.

組別Group劑量Dose(μmol/L)OD值OD value存活率Survival rate(%)正常對(duì)照組normal - 1.627±0.011 -H2O2模型組model - 0.925±0.014 56.8a Sch B 低濃度 Sch B-L 5 1.064 ±0.023 65.4a，b Sch B 中濃度 Sch B-M 10 1.156 ±0.042 71.1a，b Sch B高濃度Sch B-H 15 1.198±0.015 73.6a，b

3.2 Sch B對(duì)H2O2損傷肝細(xì)胞LDH、AST和MDA的影響

與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組培養(yǎng)上清液中LDH、AST和 MDA含量均明顯升高(P＜0.05)。Sch B各處理組與H2O2模型組相比，LDH、AST和MDA含量均有所降低，且隨著Sch B的劑量增加降低幅度越大，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。上述結(jié)果提示Sch B在體外對(duì)過氧化氫所導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷具有直接地保護(hù)作用(表2)。

表2 Sch B對(duì)H2O2損傷細(xì)胞LDH、AST和MDA的影響(n=6，±s)Table 2 Sch B reduced LDH，AST and MDA of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

表2 Sch B對(duì)H2O2損傷細(xì)胞LDH、AST和MDA的影響(n=6，±s)Table 2 Sch B reduced LDH，AST and MDA of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

組別Group劑量Dose(μmol/L)LDH值LDH value(U/L)AST值A(chǔ)ST value(U/L)MDA值MDA value(mmol/mL)正常對(duì)照組normal 14.12±0.09 51.16±0.15 2.80±0.08

注:與對(duì)照組相比，aP=0.000;與模型組相比，bP=0.000。Note:Compare with control group，aP=0.000;Compare with model group，bP=0.000.

3.3 Sch B對(duì)H2O2損傷肝細(xì)胞SOD的影響

由表3可見，L02細(xì)胞以0.4mmol/L的H2O2處理6h，H2O2模型組培養(yǎng)上清液中的SOD活力顯著降低(P＜0.05)。不同濃度的Sch B(5～15 μmol/L)均能顯著提高過氧化氫損傷肝細(xì)胞中的SOD活性(P＜0.05)，隨著Sch B的劑量增加，SOD活性也隨之增加。

表3 Sch B對(duì)H2O2損傷細(xì)胞SOD的影響(n=6，±s)Table 3 Sch B increased SOD of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

表3 Sch B對(duì)H2O2損傷細(xì)胞SOD的影響(n=6，±s)Table 3 Sch B increased SOD of H2O2oxidized L02 cells(n=6，±s)

注:與對(duì)照組相比，aP=0.000;與模型組相比，bP=0.000。Note:Compare with control group，aP=0.000;Compare with model group，bP=0.000.

組別Group劑量Dose(μmol/L)SOD值SOD value(U/ml)正常對(duì)照組normal - 12.46±0.11 H2O2模型組model - 3.56±0.09a Sch B 低濃度 Sch B-L 5 4.17 ±0.08a，b Sch B 中濃度 Sch B-M 10 6.03 ±0.13a，b Sch B高濃度Sch B-H 15 7.15±0.12a，b

4 討論

五味子乙素具有顯著的抗氧化作用，對(duì)多器官均能起到保護(hù)作用［3］:Sch B可以作用于ROS通路，阻斷NADPH的作用，從而降低高血糖小鼠的腎系膜細(xì)胞所受到的損傷［8］;Sch B亦可以顯著降低由阿霉素所導(dǎo)致的小鼠血清心肌酶的改變，顯著增加心肌組織中與氧自由基相關(guān)酶的活性，增強(qiáng)氧自由基清除系統(tǒng)的功能，明顯降低氧自由基作用于脂質(zhì)生成的脂質(zhì)過氧化物MDA的含量，從而減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷，還明顯減輕阿霉素引起的心肌超微結(jié)構(gòu)的改變，延長小鼠壽命，改善阿霉素急性心肌損傷大鼠的心功能，通過其抗氧化作用減輕心臟毒性的功能，起到抗衰老作用［9］。

根據(jù)Harman的自由基理論，過多的自由基會(huì)對(duì)機(jī)體的許多器官造成損傷，如肝臟、脾臟、腦等，尤其是肝臟最易遭受自由基的攻擊，導(dǎo)致其細(xì)胞膜發(fā)生脂類過氧化作用。由于細(xì)胞膜中富含多不飽和脂肪酸，極易受自由基攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA可直接彌散入細(xì)胞內(nèi)與各種成分相互作用。氧自由基亦可攻擊膜磷脂中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因而使雙鏈脂肪酸聚合生成MDA，后者進(jìn)入膜磷脂的水相，和膜蛋白、膜磷脂上的NH2交聯(lián)形成Schiff堿，Schiff堿會(huì)使細(xì)胞膜變硬，膜流動(dòng)性降低，通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致膜的功能損傷或喪失、肝細(xì)胞釋放大量LDH、AST等。因此，MDA的高低可以間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。

在正常生理狀態(tài)下，生物體內(nèi)存在著一定數(shù)量的自由基，適量自由基對(duì)細(xì)胞的分裂、生長、消炎、解毒等起積極作用;機(jī)體自身的抗氧化酶系SOD、GSH-Px以及CAT等能及時(shí)地清除多余的自由基，維持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡。SOD是體內(nèi)清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的酶系之一，它能催化自由基的歧化反應(yīng)、抑制黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶、清除超氧陰離子自由基等，阻止自由基與膜脂質(zhì)和膜蛋白的反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活力的高低間接反映了自由基被清除的程度和脂質(zhì)過氧化的降低程度。

H2O2是一種常用的氧化劑，細(xì)胞在接觸H2O2后會(huì)產(chǎn)生了大量的自由基，進(jìn)而打破自身的氧化-抗氧化的平衡，最終引起一系列病理過程。本研究采用H2O2制作體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷模型，選擇培養(yǎng)上清液中LDH、AST活性、肝細(xì)胞MDA含量和SOD活力作為判斷肝細(xì)胞損傷和Sch B保護(hù)作用的檢測(cè)指標(biāo)。本研究中L02細(xì)胞在受到H2O2處理后MDA含量反應(yīng)性增高，表明自由基引起機(jī)體內(nèi)生物膜上不飽和脂類的快速氧化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的Sch B不僅可以使H2O2導(dǎo)致的LDH水平、AST水平和MDA含量升高呈劑量依賴性降低，而且可使SOD活力有所恢復(fù)，可明顯改善肝細(xì)胞的損傷，并且對(duì)H2O2導(dǎo)致的肝細(xì)胞增殖率降低有恢復(fù)作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Sch B各劑量組中MDA的含量均低于模型對(duì)照組(P＜0.01)，說明Sch B可以顯著降低過氧化氫引起的MDA異常增高，這表明Sch B對(duì)自由基引起的生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有抑制作用;實(shí)驗(yàn)亦表明Sch B處理組L02細(xì)胞的抗氧化酶活力有所增強(qiáng)，可能是H2O2產(chǎn)生的過多自由基引發(fā)。這些結(jié)果都可能與Sch B的抗氧化作用相關(guān)，但Sch B在體內(nèi)是否有類似的藥理學(xué)效應(yīng)仍需進(jìn)一步研究。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，11.

2 Li XG(李曉光)，Gao Q(高勤)，Weng W(翁文)，et al.五味子有效部位及其藥理作用研究進(jìn)展.J Chin Med Mater(中藥材)，2005，28:156-159.

3 Chiu PY，Ko KM.Time dependent enhancement in mitochondrial glutathione status and ATP generation capacity by schisandrin B teatment decrease the susceptibility of rat heart to ischemia-reperfusion injury.Bio Factors，2003，19(1-2):43-51.

4 Chiu PY，Leung HY，Poon MK，et al．Chronic schisandrin B treatment improves mitochondrial antioxidant status and tissue heat shock protein production in vsriou8 tissues of young adult and middle-aged rats.Biogerontology，2006，7:199-210.

5 Cozzi R，Ricordy R，Aglitti T，et al.Ascorbic acid and B-carotene as modulators of oxidative damage.Carcinogenesis，1997，18:223-228.

6 Ji XY，Tan BK，Zhu YC，et al.Comparison of cardioprotective effects using ramipril and DanShen for the treatment of acute myocardial infarction in rats.Life Sci，2003，73:1413-1426.

7 Zhu B，Liu GT.Cytotoxic effect of hydrogen peroxide on primary cultured rat hepatocytes and its mechanisms.Chin J Pharm Toxicol，1996，10:260-266.

8 Jeong SI，Kim SJ，Kwon TH，et al．Schizandrin prevents damage of murine mesangial cells via blocking NADPH oxidaseinduced ROS signaling in high glucose.Food Chem Toxicol，2012，50:1045-1053.

9 Chin PY，Mak DH，Poon MK，et al.Role of cytoehrome P-450 in schisandrin B-induced antioxidant and heat shock responsesin mouse liver.Life Sci，2005，77:2887-2895.