夏伊麗 ，李 煌，朱 鳳(武警浙江省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，浙江 嘉興 314000)

黃連清胃丸是中藥復(fù)方制劑，處方源自國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第九冊(cè)，由梔子、知母等20 味中藥組成，具有清胃瀉火的功效，用于口舌生瘡、牙齦腫痛、胃熱牙痛、暴發(fā)火眼等癥的治療［1］。梔子和知母作為方中主要成分，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)性狀進(jìn)行了控制，未對(duì)方中任何藥物進(jìn)行定量檢測(cè)，為保證藥品質(zhì)量和臨床用藥安全有效，本文采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)法對(duì)梔子中的梔子苷、知母中的知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ進(jìn)行定量研究，為完善黃連清胃丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10ATVP 型高效液相色譜(HPLC)儀(日本島津公司生產(chǎn));Alltech 2000ES 型蒸發(fā)光散射器，ANASTAR 色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 藥品與試劑

梔子苷對(duì)照品(批號(hào):110749-201115，含量以99．7%計(jì))、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌?批號(hào):111839-201102，含量以93．2%計(jì))均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院;知母皂苷AⅢ對(duì)照品(批號(hào):41059-79-4，純度≥98．0%)購自上海純優(yōu)生物科技有限公司;黃連清胃丸(規(guī)格:每袋裝10 g;批號(hào):130901、130905、130907)購自哈爾濱同一堂藥業(yè)有限公司;乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司生產(chǎn));甲醇(色譜純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn));水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

C18色譜柱(4．6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相;柱溫為室溫;流速為0．9 ml/min;ELSD 檢測(cè)器檢測(cè)參數(shù):漂移管溫度90 ℃，載氣(N2)流速2．9 SLPM/min。理論塔板數(shù)以知母皂苷AⅢ計(jì)算應(yīng)不低于3 500［2-12］。

2.2 對(duì)照品混合溶液的制備

精密稱取梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ?qū)φ掌犯鬟m量，加50%乙醇制成梔子苷(0．061 8 mg/ml)、知母皂苷AⅢ(0．047 6 mg/ml)和知母皂苷BⅡ(0．184 2 mg/ml)的對(duì)照品混合溶液［2-12］。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，精密稱定，研成細(xì)粉，精密稱取2．0 g，精密加入50%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液［2-12］。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例稱取除梔子的其余藥味和除知母的其余藥味各1 份，按制備工藝分別制成陰性樣品，按上述供試品制備方法分別制成缺梔子的陰性對(duì)照溶液和缺知母的陰性對(duì)照溶液［2-12］。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品混合溶液1、5、10、15、20 μl，按擬定的色譜條件測(cè)定，分別以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程［2-12］。梔子苷回歸方程:Y=1．065 7X+5．367 4，r=0．999 2，知母皂苷AⅢ回歸方程:Y=1．341 6X+4．357 1，r=0．999 7，知母皂苷BⅡ回歸方程:Y=1．268 4X+6．214 1，r=0．9993，結(jié)果表明進(jìn)樣量梔子苷在0．061 8～1．236 0 μg、知母皂苷AⅢ在0．047 6～0．952 0 μg、知母皂苷BⅡ在0．184 2～3．684 0 μg 時(shí)進(jìn)樣量積分值與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 陰性對(duì)照試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺梔子的陰性對(duì)照溶液及缺知母的陰性對(duì)照溶液各10 ul，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析［2-12］，結(jié)果顯示供試品溶液色譜中，在與梔子苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌废嗤Ａ魰r(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液相同保留時(shí)間未顯吸收峰，見圖1。故認(rèn)為處方中其他藥物對(duì)該項(xiàng)含量測(cè)定無干擾。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一個(gè)供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜條件測(cè)定梔子苷、知母皂苷A Ⅲ和知母皂苷B Ⅱ的峰面積［2-12］，結(jié)果表明，儀器精密度良好，梔子苷的RSD為0．64%，知母皂苷AⅢ的RSD為0．72%，知母皂苷B Ⅱ的RSD為0．77%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于配制后0、1、2、4、6、8 h 精密吸取10 μl，測(cè)定其峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性［2-12］，結(jié)果表明，供試品溶液8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，梔子苷的RSD為0．57%，知母皂苷AⅢ的RSD為0．38%，知母皂苷BⅡ的RSD為0．91%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按上述方法制備6 份供試品溶液，分別測(cè)定其含量［2-12］，結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好，梔子苷的RSD為0．33%，知母皂苷AⅢ的RSD為0．85%，知母皂苷BⅡ的RSD為0．79%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量(梔子苷含量1．56 mg/g，知母皂苷AⅢ含量1．18 mg/g，知母皂苷BⅡ含量4．62 mg/g)的同一批號(hào)樣品，研細(xì)，取1．0 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品混合溶液25 ml，再精密加入50%乙醇25 ml，按上述供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液。精密吸取加樣供試品溶液10 μl，注入HPLC 儀，計(jì)算加樣回收率［2-12］，結(jié)果表明，本法具有良好回收率，見表1。

表1 梔子苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery test on Geniposide，Timosaponin AⅢand Timosaponin BⅡ

2.11 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品按上述測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品混合溶液5、10 μl 和供試品溶液10 μl，注入HPLC 儀測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別測(cè)定本品中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量，見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 2 Determination results of contents of samples (n=3)

圖1 梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的HPLC-ELSDFig 1 HPLC-ELSD of Geniposide，Timosaponin AⅢand Timosaponin BⅡ

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中曾對(duì)ELSD 參數(shù)進(jìn)行反復(fù)研究，最終確定乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相，流速為0．9 ml/min，漂移管溫度為90 ℃，載氣(N2)流速為2．9 SLPM/min。此時(shí)樣品中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ與其他組分峰可達(dá)基線分離，分離度良好，峰型對(duì)稱。

提取方式的選擇考慮到制劑生產(chǎn)時(shí)檢驗(yàn)的便捷性，采用超聲(功率300 W，頻率40 kHz)提取進(jìn)行試驗(yàn)，提取時(shí)間分別以20、30、40 min 進(jìn)行考察，結(jié)果30 和40 min 結(jié)果相差不大，而提取20 min 時(shí)含量明顯低于30 和40 min，因此超聲提取時(shí)間定為30 min。

本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于測(cè)定黃連清胃丸中梔子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量。

［1］ 衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑［S］．第九冊(cè)．1998:176．

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