張滿燕,熊 花,陸 煜，劉 鑫

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科)

氣道重塑為哮喘的主要病理學(xué)特征之一，氣道重塑可加重氣道高反應(yīng)性，導(dǎo)致肺功能持續(xù)性與進(jìn)行性損害，其一旦形成就很難逆轉(zhuǎn),因此防治氣道重塑是哮喘治療的重點(diǎn)。近年來(lái)研究顯示,哮喘病人被募集到呼吸道的炎性細(xì)胞都表達(dá)和分泌TGF-β1[1],TGF-β1是致呼吸道重塑的重要細(xì)胞因子之一[ 2-5 ]。

黃芪作為傳統(tǒng)中藥，能顯著調(diào)節(jié)和增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，也可調(diào)節(jié)人體細(xì)胞亞群的平衡，起加強(qiáng)呼吸道反復(fù)感染細(xì)胞免役功能作用，而且使用安全，不良反應(yīng)小[6]，但是否對(duì)氣道重塑有影響不清楚。鑒于此，本研究以豚鼠哮喘模型為研究對(duì)象，以氣道上皮組織中TGF-β1的表達(dá)作為觀察指標(biāo)，進(jìn)而闡明黃芪的平喘機(jī)制是否與TGF-β1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器

健康清潔級(jí)(SPF)雄性豚鼠40只(由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供)，12周齡左右，體重(400±50)g。卵蛋白(OVA)(美國(guó)Sigma公司)，NGF-β抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)，黃芪注射液(成都地奧九泓制藥公司生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021776)，地塞米松注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H41020036)，JSC-OK 超聲波霧化器(遼寧省鞍山市電子醫(yī)療儀器廠),自制封閉霧化吸入箱。氫氧化鋁AI(OH)3、NGF多克隆兔抗大鼠抗體、羊抗兔二抗、DAB顯色劑(博奧森生物技術(shù)有限公司)。圖像分析儀(重慶天海公司Q/TH03—1999)。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備及標(biāo)本采集

豚鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、哮喘模型組、黃芪注射液組、地塞米松組。適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，對(duì)照組不予任何處理，其他三組在第1天和第8天腹腔注射OVA(1mg)/AL(OH)3(100 mg)混合液1 mL致敏，第15天開(kāi)始以1％OVA霧化激發(fā)，每次30 min，隔天一次，共8周。每次激發(fā)前30 min，哮喘模型組、黃芪注射組、地塞米松組分別給予生理鹽水2 mL、地塞米松1.0 mg/kg、黃芪12 g/kg灌胃[7]?？乖ぐl(fā)后，以豚鼠出現(xiàn)呼吸增快，點(diǎn)頭呼吸，躁動(dòng)，唇發(fā)紺、四肢無(wú)力、行動(dòng)遲緩或俯伏不動(dòng)等代表模型復(fù)制成功。模型復(fù)制成功后，末次激發(fā)2 h內(nèi)每只腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛2 mL處死大鼠，開(kāi)胸迅速取左肺置于液氮中保存，用于提取mRNA；取右肺置于10％多聚甲醛中固定，用于HE染色及免疫組化。動(dòng)物處理：哮喘豚鼠于末次霧化吸入24 h后，以1 000 u/mL肝素鈉腹腔注射抗凝，水合氯醛(0.8g/ kg) 腹腔注射麻醉，無(wú)菌開(kāi)胸穿刺心臟取血處死豚鼠，迅速取左肺置于液氮中保存，用于提取mRNA；取右肺置于10％多聚甲醛中固定，用于HE染色及免疫組化。

1.3 肺組織病理HE染色

通過(guò)氣管插管導(dǎo)管(由中心靜脈導(dǎo)管改成)灌注10％中性甲醛使肺葉充分膨脹，肺組織置于10％中性甲醛中固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，切片行HE染色。

1.4 氣道形態(tài)學(xué)分析

采用圖像分析軟件,測(cè)定氣管腔的內(nèi)周長(zhǎng)(Pi)、管壁面積(WA)、外周長(zhǎng)(Pe)、氣道平滑肌的面積、氣道平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N),用管腔的內(nèi)周長(zhǎng)(Pi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,分別以WA/Pi、氣道平滑肌的面積/Pi、N/Pi表示。肺組織切片在光學(xué)顯微鏡下放大 200 倍，每張切片均選取上、中、下3個(gè)視野中完整的小支氣管[500 μm < 支氣管基底膜周徑(Pbm)< 1 500 μm]，采用圖像采集系統(tǒng)獲取圖像后，用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定支氣管基底膜周徑(Pbm) 、總管壁面積(Wat) 、內(nèi)管壁面積(Wai) 、氣道平滑肌面積(Wam) ，將測(cè)得的后3個(gè)值除以 Pbm 進(jìn)行標(biāo)化，分別代表總管壁標(biāo)化厚度(Wat/ Pbm) 、內(nèi)管壁標(biāo)化厚 度 (Wai/ Pbm) 、平 滑 肌 標(biāo) 化 厚 度 (Wam/Pbm)(見(jiàn)表1)。

1.5 免疫組化檢測(cè)氣道中TGF-β1蛋白的表達(dá)

TGF-β1蛋白表達(dá)采用鏈霉親和素-生物素-酶(SABC)免疫組化染色法測(cè)定。豚鼠肺組織標(biāo)本石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟，抗原沸熱修復(fù)，3％H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉非特異性抗原，加一抗TGF-β1單克隆抗體4 ℃冰箱過(guò)夜，第二天切片恢復(fù)室溫后，依次加生物素標(biāo)記的二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木精襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明封片，用已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)用PBS代替一抗為陰性對(duì)照。胞膜或胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒且著色明顯高于背景者為陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果在 400 倍視野下，每張玻片隨機(jī)取 10 個(gè)視野，用BLTS2080病理圖象采集系統(tǒng)和Image Pro Plus 5.02專業(yè)圖像分析軟件，分別測(cè)定陽(yáng)性顆粒的平均光密度值，進(jìn)行分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用 SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析法，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氣道形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組氣道上皮完整，杯狀細(xì)胞少見(jiàn)，支氣管、細(xì)支氣管管壁平滑肌層較薄，黏膜皺襞矮平，肺泡間隔正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少見(jiàn)。哮喘組氣道壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，杯狀細(xì)胞增生，氣道平滑肌增殖，支氣管管腔變窄，氣道上皮細(xì)胞脫落，平滑肌增生肥大，支氣管周圍和黏膜層及肺泡壁Eos明顯增多， 肺泡間隔增厚，管腔可見(jiàn)粘液栓，表現(xiàn)出氣道慢性炎癥特征和非特異性的氣道高反應(yīng)性。黃芪治療組和地塞米松治療組經(jīng)治療后，其改變基本接近對(duì)照組，同哮喘組相比，支氣管以及肺泡區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺泡隔明顯變薄，肺泡腔變大，支氣管管壁增厚和管腔狹窄均減輕(圖1)。

圖1 氣道形態(tài)學(xué)變化(HE染色×400)

2.2 氣道重塑圖像分析

圖像分析結(jié)果表明,哮喘組氣道壁厚度(WA/Pi)、氣道平滑肌厚度(平滑肌的面積/Pi)分別較對(duì)照組顯著增加26％(t=4.523,P<0.01)和58％(t=3.788,P<0.01)。氣道平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi)哮喘組亦高于對(duì)照組23％(t=3.712,P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 哮喘組與對(duì)照組WA/Pi、平滑肌的面積/Pi、N/Pi比較(n=10)

2.3 豚鼠氣道TGF-β1蛋白的表達(dá)

哮喘組切片可見(jiàn)氣道黏膜、黏膜下層、肺泡區(qū)有大量呈棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞(圖2B)；對(duì)照組切片可見(jiàn)氣道黏膜、黏膜下層、肺泡區(qū)有少量呈棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞(圖2A)。平均光密度值分析比較，哮喘組TGF-β1的平均光密度值均明顯高于對(duì)照組，示哮喘組TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，而黃芪治療組(圖2C)及地塞米松治療組(圖2D)TGF-β1F的表達(dá)相對(duì)于哮喘組均有不同程度的減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

圖2 TGF-β1的表達(dá)(HE,×400)

表2 各組大鼠支氣管上皮VEGF、TGF-β1蛋白的積分光密度IOD值(n=10)

3 討 論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，多種細(xì)胞和炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子參與哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前國(guó)內(nèi)外通用的哮喘診治方案，均強(qiáng)調(diào)對(duì)氣道炎癥控制，而對(duì)氣道炎癥損傷后的氣道重塑機(jī)制重視不夠。在氣道炎癥環(huán)境下，氣道壁上皮脫落、平滑肌收縮、平滑肌細(xì)胞增生和肥大等，都會(huì)使氣道壁面積明顯增大，氣道內(nèi)徑縮小。因此，針對(duì)氣道重塑的研究成為哮喘防治的新方向，對(duì)哮喘患者，特別是早期患者的預(yù)后具有重要意義。

目前公認(rèn)治療哮喘最有效的藥物是糖皮質(zhì)激素,但長(zhǎng)期服用激素可形成激素依賴和激素抵抗，產(chǎn)生許多副作用。吸入性糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC) 已被公認(rèn)為哮喘治療的一線藥物，在臨床中可看到部分病人，尤其是反復(fù)發(fā)作的患者，即使給予抗炎與支氣管擴(kuò)張治療，仍氣流阻塞，其主要原因在于氣道重塑[8]。越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β1在哮喘氣道重塑過(guò)程中起到重要作用。TGF-β1被認(rèn)為是纖維化疾病過(guò)程中最為關(guān)鍵的致纖維化因子[9]。在哮喘氣道中TGF-β1主要來(lái)自氣道上皮、纖維母細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，氣道中TGF-β1表達(dá)增高,能刺激氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC) 分裂與增殖,導(dǎo)致平滑肌增生和肥厚[10]，且TGF-β參與氣道上皮損傷、ECM沉積和上皮下纖維化、杯狀細(xì)胞增生、ASM重塑及微血管生成等，Khalil[11]。等認(rèn)為T(mén)GF-β1 通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生PDGF和TNF-β來(lái)調(diào)節(jié)炎癥和纖維化過(guò)程。

近年來(lái)，黃芪作為純中藥免疫調(diào)節(jié)劑防治哮喘受到學(xué)者的重視[12]，其藥理研究表明,黃芪主要化學(xué)成分為黃芪甲甙、黃芪多糖等，具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥作用,可通過(guò)降低患者氣道高反應(yīng)性,調(diào)節(jié)患者免疫功能，而對(duì)支氣管哮喘有一定的治療作用[13]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們觀察到黃芪組以及激素干預(yù)組的豚鼠出現(xiàn)典型的哮喘癥狀相對(duì)要輕。黃芪組治療后氣道上皮脫落、膠原沉積、氣道平滑肌增加、氣道壁增厚等氣道重塑的特征明顯減輕，提示黃芪組對(duì)哮喘炎癥和氣道重塑有較好的抑制作用。哮喘防治的關(guān)鍵則是采用早期干預(yù)的手段有效地控制哮喘氣道炎癥及防止氣道重塑的發(fā)生。哮喘的氣道重塑過(guò)程中，TGF-β1具有重要的調(diào)控作用，其在很大程度上促使或誘發(fā)氣道重塑的發(fā)生。黃芪可能通過(guò)抑制TGF-β1在哮喘豚鼠肺組織中的表達(dá)，從而達(dá)到抑制氣道重塑的作用，減輕哮喘癥狀，避免或延緩肺功能的進(jìn)一步損害。同時(shí)，黃芪作為中藥制劑，副作用小，極可能成為防治哮喘較具前途藥物。

經(jīng)黃芪干預(yù)治療后，氣道重塑明顯減輕，而且TGF-β1表達(dá)量也下降，故提示TGF-β1在氣道重塑中起著重要作用。抑制TGF-β1的表達(dá)可能阻止或減輕哮喘的氣道重塑。說(shuō)明黃芪可以從減少氣道TGF-β1的表達(dá)來(lái)影響氣道重塑。

[1]Halwani R，Al-muhsen S，Al-jahdali H,et al.Role of transforming growth factory-βin airway remodeling in asthma[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2011,44(2):127-133.

[2]Salam MT,Gauderman WJ,McConnell R,et al.Transforming growth factor-β1 C-509T polymorphism,oxidant stress,and early-onset childhood asthma[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(12):1192-1199.

[3]管小俊,張維溪,李昌崇,等.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 在哮喘呼吸道重塑中的作用以及糖皮質(zhì)激素的調(diào)控[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2007,87(25):1767-1772.

[4]Alcorn JF,Rinaldi LM,Jaffe EF,et al.Transforming growth factor-β1supp resses airway hyperresponsiveness in allergic airway disease[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(10):974-982.

[5]Yamaguchi M,Niimi A,Matsumoto H,et al.Sputum levels of transforming growth factor-β1 in asthma:Relation to clinical and computedtomography findings[J].Am J Investig Allergol Clin Immunol,2008,18(3):202-206.

[6]聶瓊芳,易屏.黃芪對(duì)反復(fù)呼吸道感染患者體內(nèi) SIL-2R、IL-8 及 Ig的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009,25(4):362-364.

[7]陶伍元,張文武.黃芪注射液對(duì)急性肺損傷大鼠熱休克蛋白70核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)的影響[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2012,32(3):227-231.

[8]鐘南山.支氣管哮喘-基礎(chǔ)與臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2006：438.

[9]Wen FQ,Kohyama T,Skold CM,et al.Glucocorticoids molecular TGF-beta production by human fetal lung fibroblast[J].Inflammation,2003，27(1):9-19.

[10]李明才，何韶衡.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β與哮喘[J].生命的化學(xué),2003,23 (1):57-58.

[11]Khalil N，O’Cnnor RN，F(xiàn)landers KC，et al.TGF-β，but not TGF-βor TGF-βis diferentially present on epithelial cellsof advanced pulmonary fibrosis:all immunohisto chemicl study[J].Am J Respire Cell Mol Biol，1996,14(2):131.

[12]鮑志堅(jiān)，徐儉樸，樓景英.黃芪復(fù)方對(duì)哮喘患者氣道高反應(yīng)性的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,11(2):30-31.

[13]黃翠萍,楊和平,楊穎喬.黃芪注射液對(duì)哮喘大鼠 p38 蛋白激酶和白細(xì)胞介素 -5 表達(dá)的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2008,13(8):900-903.