呂運成，彭 超，姚 峰，唐艷艷，張 熠，徐 菁，劉政海，唐朝克

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究所；2.南華大學(xué)臨床應(yīng)用解剖研究室，湖南 衡陽 421001；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究所)

miR-19b為一種內(nèi)生性的microRNA，在哺乳動物體內(nèi)存在兩種亞型(miR-19b-1與miR-19b-2)，分別由13號常染色體和X染色體產(chǎn)生，但兩者序列完全相同。miR-19b在心肌細(xì)胞、單核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達，在人和鼠As斑塊中過量表達[1-3]。高脂飲食上調(diào)miR-19b表達，促進皮下和內(nèi)臟脂肪的沉積[4]。這些研究初步提示miR-19b可參與調(diào)控脂質(zhì)代謝，與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的進展密切相關(guān)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-19b可靶向結(jié)合三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1 (ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)3′ 非編碼區(qū)(3′ untranslated region，3′ UTR)，且二者結(jié)合的自由能較低。人ABCA1 3′ UTR存在三個miR-19b結(jié)合位點，鼠ABCA1 3′ UTR存在兩個結(jié)合位點。這就提示miR-19b可靶向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ABCA1表達，而ABCA1介導(dǎo)脂質(zhì)流出對抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和AS進展起著關(guān)鍵作用[5]。本研究將采用Western blot、熒光定量PCR等技術(shù)檢測miR-19b對THP-1源性巨噬細(xì)胞ABCA1的mRNA及蛋白水平的影響，證實miR-19b是否調(diào)控巨噬細(xì)胞ABCA1的表達。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人單核細(xì)胞株THP-1購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自Solarbio公司，胎牛血清購自杭州四季清生物公司，牛血清白蛋白購自上海生工。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自北京諾博萊德公司。miR-19b mimic/inhibitor及riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑盒均購自廣州銳博公司。ABCA1抗體購自ABCam公司，β-actin抗體購自武漢博士德公司。Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Invitrogen公司。熒光定量PCR試劑盒購自康為世紀(jì)公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

THP-1 細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，37 ℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將THP-1細(xì)胞種植到六孔板，用160 nM PMA孵育細(xì)胞24 h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。實驗前制備miRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液：miR-19b mimic為250 μL buffer+4 μL mimic+25 μL reagent+1721 μL無血清培養(yǎng)液(mimic終濃度為40 nM)，miR-19b inhibitor為250 μL buffer+8 μL inhibitor+25 μL reagent+1717 μL無血清培養(yǎng)液(inhibitor終濃度為80 nM)。棄去舊培養(yǎng)液后加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。

1.3 Western blot

收集處理后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃離心10 min，棄去沉淀。以4∶1加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。10％SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，12V恒壓半干轉(zhuǎn)膜45 min后，麗春紅染色5 min觀察轉(zhuǎn)膜效果。5％脫脂牛奶封閉2h，按1∶1000加入羊抗人ABCA1一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，1∶1000 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗羊二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，用Tanon 5500免疫熒光檢測系統(tǒng)激發(fā)熒光，Tanon MP軟件攝取圖像，Tanon CAL軟件分析獲取各條帶的光密度值。

1.4 熒光定量PCR

用trizol試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用LightCycler480熒光定量PCR儀進行實時定量PCR，反應(yīng)體系為50 μL，含2×UltraSYBR Mixture 25 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL，buffer 21 μL。95 ℃預(yù)變性10 min后，再按95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。收集60 ℃時的熒光信號。人ABCA1引物為，5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAAT AGTTGT-3′和5′-CCCGGAAACGCAAGTC C-3′。β-actin的表達用作內(nèi)參照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-19b對巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白水平的影響

將THP-1巨噬細(xì)胞分為3組：(1)空白對照組，培養(yǎng)液中不加任何其他物質(zhì)；(2)miR-19b mimic組：培養(yǎng)液中加入40 nM/L miR-19b mimic；(3)miR-19b inhibitor組：培養(yǎng)液中加入80 nM/L miR-19b inhibitor。miR-19b mimic組ABCA1蛋白表達較空白對照組明顯降低。miR-19b inhibitor組ABCA1蛋白表達與空白對照組比較明顯上調(diào)。這就表明miR-19b可抑制巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-19b mimic及其inhibitor 24 h后THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA蛋白表達的變化

2.2 miR-19b對巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA水平的影響

將THP-1巨噬細(xì)胞分組如上。miR-19b mimic組ABCA1 mRNA水平較空白對照組明顯降低。miR-19b inhibitor組ABCA1 mRNA水平與空白對照組比較無變化。這就表明miR-19b可下調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA的水平(圖2)。

3 討 論

巨噬細(xì)胞ABCA1的表達水平受到胞內(nèi)各種調(diào)控因子的嚴(yán)密調(diào)控[6-7]。本研究采用Western blot和熒光定量PCR檢測了miR-19b對巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白及其mRNA水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-19b顯著抑制巨噬細(xì)胞ABCA1的表達。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-19b mimic及其inhibitor 24h后THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1mRNA表達的變化

MiR-19在轉(zhuǎn)錄后水平抑制巨噬細(xì)胞ABCA1的表達。我們在前期的生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)miR-19b可直接靶向作用ABCA1 3′UTR，且二者結(jié)合的自由能較低，這就提示miR-19b可在生理或者病理條件下調(diào)控ABCA1的表達。本研究在人源性THP-1巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-19b mimic與inhibitor，從而增強或抑制miR-19b的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABCA1蛋白及其mRNA水平均下調(diào)。這些結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測分析一致，并且在體外細(xì)胞水平證實了miR-19b對ABCA1表達的調(diào)控作用。

miR-19b下調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1的表達對As的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。ABCA1在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)流出及HDL生成中起著關(guān)鍵作用[8]。抑制ABCA1的表達與功能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)受阻，從而導(dǎo)致血管壁脂質(zhì)沉積和As的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明miR-19b在人As斑塊中高表達，而在正常動脈壁上無表達。這就提示miR-19b抑制ABCA1表達參與了As發(fā)生發(fā)展的過程。

本研究初步證實了miR-19b調(diào)控巨噬細(xì)胞ABCA1的表達，但是miR-19b對ABCA1的具體調(diào)控機制、體內(nèi)驗證miR-19b的調(diào)控作用及其對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)流出和As發(fā)生發(fā)展的影響有待進一步研究?？傊?，全面揭示miR-19b對ABCA1的調(diào)控作用及其機制，使其有望成為調(diào)控RCT及防治AS的新靶點。

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