周 君，何紅晨,肖 登,陳世菊,劉慧芳,覃渝茜,何成奇

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，湖南 衡陽421001；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院康復(fù)科 康復(fù)醫(yī)學(xué)四川省重點實驗室)

骨質(zhì)疏松癥是一種伴隨增齡衰老或醫(yī)學(xué)原因引起的以骨量降低、骨微細結(jié)構(gòu)受損導(dǎo)致骨脆性增加和易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。隨著中國人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥及其骨質(zhì)疏松性骨折這一問題也更加突出，嚴重影響中老年人的生活質(zhì)量，并且醫(yī)療支出巨大，給個人、家庭、社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。臨床研究表明脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields，PEMFs)[2-3]和針灸[4]均能增加骨密度、緩解患者疼痛癥狀及提高患者生活質(zhì)量，顯示出很廣的臨床應(yīng)用前景。本課題組前期實驗研究顯示脈沖電磁場[5-6]和電針療法[7]均能改善骨代謝生化指標、增加骨密度及改善骨生物力學(xué)性能。骨質(zhì)疏松癥作為一種多因性、復(fù)雜的慢性疾病，應(yīng)進行綜合康復(fù)治療。進行多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用以求發(fā)揮最大協(xié)同療效的研究是有意義的，必將更好地為患者服務(wù)。本研究觀察脈沖電磁場聯(lián)合電針療法對去卵巢大鼠骨密度、骨組織形態(tài)和骨生物力學(xué)性能指標的影響，探索聯(lián)合治療是否具有協(xié)同作用，為脈沖電磁場聯(lián)合電針療法應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療作理論和實踐的探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

XT-2000B型骨質(zhì)疏松治療治療儀(中國，天津)；華佗牌SDZ-V型電針治療儀(中國，江蘇)；雙能X線骨密度測量儀(DEXA，美國)；Laica切片機(德國)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本)；AGS-J電子萬能試驗機(日本)。3月齡未育雌性Sprague-Dawley大鼠50只，由四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 實驗動物飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西醫(yī)院動物實驗中心，清潔級環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法把50只實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、去勢組、脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組，每組10只。參照文獻[8]，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均施行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素4萬U，每天1次，連用3天以預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢周圍與卵巢大小相仿的脂肪組織。每只實驗大鼠分籠飼養(yǎng)在溫度20～26℃、濕度60％～70％、12 h間隔照明的環(huán)境中，自由攝食和水。

1.2.2 干預(yù)方法 去卵巢術(shù)后1周，各治療組給予相應(yīng)干預(yù)治療。脈沖電磁場組：采用XT-2000B型骨質(zhì)疏松治療治療儀,具體干預(yù)參數(shù)為：強度3.82 mT，頻率8 Hz，時間每次40 min，每天1次，每周5天，共12周。電針組：穴位雙側(cè)“足三里”、 “三陰交”，采用直徑0.25 mm、長度25 mm一次性無菌針灸針刺入，進針后針柄連接電針，波形為疏密波，疏波頻率3 Hz，密波頻率15 Hz，波寬1 ms，強度以局部肌肉輕微收縮為度 (0.7～1.0 mA)，每次30 min，每天1次，每周5天，共12周。聯(lián)合組：采用脈沖電磁場聯(lián)合電針療法，具體操作同以上兩組。假手術(shù)組和去勢組不予任何干預(yù)。

1.2.3 標本采集及組織形態(tài)學(xué)觀察 干預(yù)12周后，處死大鼠后，迅速取出左側(cè)股骨，剝離肌肉,用于骨密度和生物力學(xué)性能檢測；取出左側(cè)脛骨，生理鹽水沖洗,40 g/L中性緩沖甲醛固定,100 g/L乙二胺四乙酸二鈉脫鈣,每2天更換脫鈣液1次,共脫鈣4周,系列乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度5 μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 骨密度測定 用雙能X線骨密度測量儀測定實驗動物左股骨骨密度,將股骨放在盛有深約2.5 cm的蒸餾水(用于模擬骨周圍的軟組織)的容器中，用小動物軟件進行掃描。測量完畢后，股骨標本用生理鹽水濕紗布包裹后保存于-20℃環(huán)境中，以備生物力學(xué)測定。

1.2.5 骨生物力學(xué)性能測定 測量時取出標本復(fù)溫后，在電子萬能材料試驗機上做股骨三點彎曲試驗和L5椎體壓縮試驗，直到骨折。三點彎曲試驗時支點跨距為20 mm，兩個試驗的加載速度均為2 mm/min，用函數(shù)記錄儀描記載荷-位移曲線，記錄最大載荷和破壞能2個指標。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 骨密度檢測

左股骨骨密度與假手術(shù)組比較，去勢組骨密度明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組的骨密度比去勢組顯著增高(P<0.01，P<0.05)；而脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組3組之間股骨骨密度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。L5椎體骨密度與假手術(shù)組比較，去勢組骨密度明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組的骨密度比去勢組顯著增高(P<0.01)；與脈沖電磁場組和電針組比較，聯(lián)合組L5椎體骨密度明顯增高(P<0.05)(圖1)。

圖1 股骨及L5椎體骨密度檢測

2.2 骨組織形態(tài)學(xué)觀察

如圖2所示，與假手術(shù)組比較，去勢組骨小梁面積、骨小梁數(shù)量和骨小梁鏈接數(shù)明顯減少，骨髓腔顯著增大；然而，經(jīng)過12周干預(yù)治療后，脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組與去勢組比較，骨小梁面積、骨小梁數(shù)量和骨小梁鏈接數(shù)明顯增加，而骨髓腔顯著減少。

圖2 干預(yù)12周后各組脛骨HE染色結(jié)果(×100)

2.3 骨生物力學(xué)檢測

股骨三點彎曲試驗發(fā)現(xiàn)(圖3)，與假手術(shù)組比較，去勢組最大載荷明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場組和聯(lián)合組的最大載荷比去勢組顯著增高(P<0.05)；而脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組3組之間最大載荷無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，去勢組破壞能明顯下降(P<0.05)；脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組的破壞能與去勢組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

L5椎體壓縮試驗發(fā)現(xiàn)(圖4)，與假手術(shù)組比較，去勢組最大載荷明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場組、電針和聯(lián)合組的最大載荷比去勢組顯著增高(P<0.01)；與脈沖電磁場組和電針組比較，聯(lián)合組最大載荷明顯增高(P<0.05，P<0.01)。與假手術(shù)組比較，去勢組破壞能明顯下降(P<0.01)；與去勢組比較，脈沖電磁場組、電針組和聯(lián)合組的破壞能顯著增高(P<0.01)；與脈沖電磁場組和電針組比較，聯(lián)合組破壞能明顯增高(P<0.01)。

3 討 論

圖3 股骨三點彎曲試驗

圖4 L5椎體壓縮試驗

隨著全球人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率逐漸上升。目前，尚無確切的全國性骨質(zhì)疏松癥患病率資料，國內(nèi)部分地區(qū)(北京、石家莊、上海、長春、廣州和成都)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥總患病率(按骨密度累計丟失率最高部位計算)為12.4％[9],50歲以上人群總骨折患病率為26.6％,髖部骨折患病率為1.9％，脊椎骨折患病率為13.3％[10]。2005年美國超過200萬人發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折，直接經(jīng)濟花費為170億美元[11]。骨質(zhì)疏松癥及其骨質(zhì)疏松性骨折嚴重影響中老年人的生活質(zhì)量，并且相關(guān)醫(yī)療花費巨大，給個人、家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，探索骨質(zhì)疏松癥的有效而安全的治療方法，具有肯定的社會效益和經(jīng)濟效益。

骨質(zhì)疏松癥作為一種常見多發(fā)的慢性疾病，臨床上常進行綜合康復(fù)治療，探討多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用以求發(fā)揮最大協(xié)同療效并研究其作用機制具有重要意義。目前國內(nèi)外僅見1項有關(guān)脈沖電磁場聯(lián)合電針治療骨質(zhì)疏松癥的臨床研究報告[12]，而未見有關(guān)基礎(chǔ)實驗研究。因此，本研究擬通過觀察脈沖電磁場、電針及脈沖電磁場聯(lián)合電針療法對去卵巢大鼠骨密度、骨組織形態(tài)、骨生物力學(xué)性能的影響，探索脈沖電磁場與電針是否具有協(xié)同作用。作為治療骨質(zhì)疏松癥的新技術(shù)，脈沖電磁場的有效性正受到業(yè)界高度關(guān)注，脈沖電磁場對骨質(zhì)疏松引起的疼痛、骨量丟失、骨密度降低具有肯定的治療作用[2-3]。前期實驗研究[5-6]也顯示脈沖電磁場能提高去勢大鼠血清雌二醇水平、增加去勢大鼠骨密度，改善骨生物力學(xué)性能。臨床研究顯示針灸也能增加骨質(zhì)疏松癥患者骨密度、緩解患者疼痛癥狀及提高患者生活質(zhì)量[4]。盡管中醫(yī)學(xué)中無骨質(zhì)疏松癥這一病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”范疇，其病理基礎(chǔ)是腎虛和脾虛，病變的臨床表現(xiàn)多為瘀血阻絡(luò)之像，針灸治療以補益脾腎、強筋健骨為治療原則。前期研究表明針刺足三里、三陰交能改善去勢大鼠骨代謝生化指標、提高骨密度、改善骨生物力學(xué)性能，激活成骨細胞Wnt/β-catenin信號通路，促進骨形成[7]。足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴，三陰交為足三陰經(jīng)的交會穴，針刺這兩個穴位能補腎健脾，益髓補骨，強筋健骨。所以，在本研究中選用電針足三里及三陰交這兩個穴位。

骨密度是衡量骨量多少的定量指標，可以測量出不同部位如髖部或脊柱的骨礦物質(zhì)的含量，骨密度已經(jīng)成為診斷骨質(zhì)疏松癥的金標準[1]。基于去勢大鼠皮質(zhì)骨和小梁骨骨量丟失程度和速度的差異性[13]，本研究分別檢測小梁骨豐富的L5椎體和皮質(zhì)骨為主的股骨的骨密度。本研究中去勢導(dǎo)致大鼠股骨骨密度下降，而脈沖電磁場、電針及聯(lián)合療法均能增加其骨密度，但是聯(lián)合療法并不比脈沖電磁場、電針單獨使用療效更好。對于小梁骨豐富的L5椎體，在去勢手術(shù)后，骨密度顯著降低，而脈沖電磁場、電針和聯(lián)合療法均能增加其骨密度，而且，聯(lián)合療法增加骨密度的療效還優(yōu)于脈沖電磁場或電針單獨使用的療效。本研究結(jié)果顯示脈沖電磁場、電針及聯(lián)合療法均能增加去勢大鼠L5椎體及股骨骨密度，而且，對于腰椎骨密度的提高，脈沖電磁場聯(lián)合電針療法具有協(xié)同作用，而對股骨骨密度的提高，聯(lián)合治療并不優(yōu)于脈沖電磁場或電針單獨使用。聯(lián)合療法對L5椎體和股骨骨密度提高程度不同，這可能與股骨主要由皮質(zhì)骨組成，L5椎體由小梁骨組成的結(jié)構(gòu)差異性造成的。

骨的生物力學(xué)性能由骨量和骨的質(zhì)量兩方面決定[14]。骨量可以用定量指標骨密度去衡量，而骨質(zhì)量包括一系列的骨組織特性：骨的形態(tài)、微細結(jié)構(gòu)、微損傷程度等。所以，本研究觀察了脈沖電磁場、電針及聯(lián)合治療對去勢大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過12周干預(yù)治療后，脈沖電磁場、電針和聯(lián)合療法均能增加骨小梁面積、骨小梁數(shù)量和骨小梁鏈接數(shù)明顯增加，減少骨髓腔的大小。

骨生物力學(xué)性能是反映骨易碎性的指標，可以預(yù)測骨折發(fā)生的風(fēng)險，改善骨的生物力學(xué)性能，是目前判斷一種治療方法治療骨質(zhì)疏松癥是否有效的一個關(guān)鍵指標[15]。在骨質(zhì)疏松癥患者，最關(guān)心的就是骨的生物強度，對于正常骨不引起骨折的負荷而在骨質(zhì)疏松癥中而可以導(dǎo)致骨折。所以很多研究探索了骨量丟失在骨的生物力學(xué)性能下降中的重要程度，對絕經(jīng)后婦女或動物模型的骨組織進行了各種各樣的生物力學(xué)檢測，包括壓縮、彎曲、剪切等。骨質(zhì)疏松癥患者椎體的最大應(yīng)力和最大彈性模量下降[16]，去勢動物模型的椎體壓縮和股骨三點彎曲試驗都提示骨生物力學(xué)性能下降[17]。本研究觀察了脈沖電磁場、電針及聯(lián)合療法對股骨三點彎曲試驗和椎體壓縮試驗的影響，結(jié)果顯示去勢大鼠股骨和L5椎體的最大載荷和破壞能顯著下降。脈沖電磁場、聯(lián)合療法可以增加股骨的最大載荷，而脈沖電磁場、電針及聯(lián)合療法對股骨破壞能沒有明顯影響。脈沖電磁場、電針及聯(lián)合療法均能增加腰椎的最大載荷和破壞能，并且聯(lián)合療法優(yōu)于脈沖電磁場或電針單獨治療。

本研究結(jié)果顯示脈沖電磁場聯(lián)合電針療法對去勢大鼠股骨骨密度及生物力學(xué)性能改善并不優(yōu)于脈沖電磁場或電針療法單獨使用，而聯(lián)合療法對椎體骨密度及生物力學(xué)性能改善明顯優(yōu)于脈沖電磁場或電針療法單獨使用，提示盡管這兩種治療方法協(xié)同作用機制尚不明確，在臨床聯(lián)合應(yīng)用脈沖電磁場和電針療法對骨質(zhì)疏松癥患者腰椎骨密度和生物力學(xué)性能的改善可能比這兩種治療方法單獨使用更為有效。對于協(xié)同作用的機制及兩種治療方法的安全性尚需進一步的研究。

[1]Warriner AH,Saag KG.Osteoporosis diagnosis and medical treatment[J].Orthop Clin North Am,2013，44(2):125-135.

[2]Liu HF,Yang L,He HC,et al.Pulsed electromagnetic fields on postmenopausal osteoporosis in Southwest China:a randomized,active-controlled clinical trial[J].Bioelectromagnetics,2013,34(4):323-332.

[3]Liu H,Yang L,He H,et al.The hemorheological safety of pulsed electromagnetic fields in postmenopausal women with osteoporosis in southwest China:A randomized,placebo controlled clinical trial[J].Clin Hemorheol Microcirc,2013,55(3):285-295.

[4]農(nóng)澤寧,趙利華,韋良玉,等.補肝腎健脾溫針灸法防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及骨量減少的臨床研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(8):1575-1578.

[5]Zhou J,Chen S,Guo H,et al.Pulsed electromagnetic field stimulates osteoprotegerin and reduces RANKL expression in ovariectomized rats[J].Rheumatol Int,2013,33(5):1135-1141.

[6]Zhou J,He H,Yang L,et al.Effects of pulsed electromagnetic fields on bone mass and Wnt/beta-catenin signaling pathway in ovariectomized rats[J].Arch Med Res,2012,43(4):274-282.

[7]Zhou J,Chen S,Guo H,et al.Electroacupuncture prevents ovariectomy-induced osteoporosis in rats:a randomised controlled trial[J].Acupunct Med,2012,30(1):37-43.

[8]Yang X,Chan YH,Muthukumaran P,et al.Ibandronate does not reduce the anabolic effects of PTH in ovariectomized rat tibiae:a microarchitectural and mechanical study[J].Bone,2011,48(5):1154-1163.

[9]李寧華,朱漢民,區(qū)品中,等.中國部分地區(qū)中老年人群原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患病率研究[J].中華骨科雜志,2001,21(5):275-278.

[10]李寧華.中國中老年人群骨折患病率調(diào)查[J].中國臨床康復(fù),2003,7(8):1284-1285.

[11]Burge R,Dawson-Hughes B,Solomon DH et al.Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States,2005-2025[J].J Bone Miner Res,2007,22(3):465-475.

[12]王娟,艾顯江.低頻脈沖磁療結(jié)合電針治療骨質(zhì)疏松47例[J].首都醫(yī)藥,2008,1(2):34.

[13]Ominsky MS,Li X,Asuncion FJ,et al.RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats[J].J Bone Miner Res,2008,23(5):672-682.

[14]Judex S,Boyd S,Qin Y,et al.Combining high-resolution micro-computed tomography with material composition to define the quality of bone tissue[J].Current osteoporosis reports,2003,1(1):11-19.

[15]Hernandez CJ,Keaveny TM.A biomechanical perspective on bone quality[J].Bone,2006,39(6):1173-1181.

[16]Hasegawa K,Takahashi H,Koga Y,et al.Failure characteristics of osteoporotic vertebral bodies monitored by acoustic emission[J].Spine (Phila Pa 1976),1993,18(15):2314-2320.

[17]Ominsky MS,Li X,Asuncion FJ,et al.RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats[J].Journal of Bone and Mineral Research,2008,23(5):672-682.