薛秀蘭 邢玉剛 吳曉鷺 劉家俊

（1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，廈門361000；2江蘇省昆山市中醫(yī)院內(nèi)科 昆山215300）

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。它由肝星狀細胞（HSC）被激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細胞（（MFB），大量合成細胞外基質(zhì)（ECM），后者的沉積大于降解而形成。瘦素（leptin）是由ob基因（位于人類染色體7q32）編碼的一種167個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。leptin與受體結(jié)合后，通過Janus家族酪氨酸激酶／信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK／STAT，其中主要是JAK／STAT 3）通道和增強TGFβ1及α1Ⅰ型膠原的基因表達［1］發(fā)揮作用。最新的實驗研究表明，leptin作為新的肝纖維化形成因子，其機制研究已越來越引起人們的關(guān)注［2，3］。但瘦素在肝硬化發(fā)展中的具體作用尚未明確。本實驗采用RNA干擾技術(shù)［4］針對leptin特意靶位點的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）處理大鼠肝硬化模型，探討siRNA抑制leptin基因?qū)Υ笫蟾斡不挠绊?，為進一步以leptin為靶點的基因治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1 實驗動物 健康純種SD雌性大鼠，體質(zhì)量200－230g，SPF級，由廈門大學(xué)動物實驗中心提供，飼料由廈門大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 試劑與儀器 脂質(zhì)體Lipofectmine 2000及 Trizol Reagent：美國Invitrogen公司產(chǎn)品；UNIQ大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒：上海Sangon公司產(chǎn)品；RT－PCR引物由上海生工公司合成。PTPCR二步法試劑盒：北京百泰克公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶Bbs I、Ase I、T4DNA連接酶、高保真Taq酶 Pyrobest、d NTPs（d ATP、d TTP、d GTP、d CTP的混合物）、DNA片段回收試劑盒以及質(zhì)粒純化試劑盒均購自Takara公司；M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin（RNA酶抑制劑）購自Promega公司。真核表達載體psiRNA－h(huán) H1neo kit購自Invitrogen公司。HRP標記的羊抗兔IgG購自華美公司。TGFβ1一抗和leptin、STAT3一抗購自 Promega公司，αSMA 一抗和 desmin、collagenⅠ、NF－KB 一抗購自Santa Cruz公司凝膠成像系統(tǒng)為BIO－RAD公司Quantity One系統(tǒng)。彩色病理圖文分析系統(tǒng)為OLYMPUS－DP70系統(tǒng)。

2.實驗方法

2.1 質(zhì)粒制備 采用本課題組構(gòu)建的leptinsiRNA／pcDNA3.1（＋）真核細胞表達質(zhì)粒，通過測序，證實構(gòu)建成功。采用上海生工公司質(zhì)粒大量抽提試劑盒（方法詳見說明）行質(zhì)粒大量制備。經(jīng)酶切及電泳證實抽出質(zhì)粒，用分光光度計測定濃度，經(jīng)計算符合所需量。

2.2 模型制備 重組質(zhì)粒導(dǎo)入60只大鼠隨機分為4組：正常對照組（N組，n＝15），以正常飲食喂養(yǎng)；肝纖維化組（CCl4組，n＝15）；leptin－siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（CCl4（＋）L組，n＝15）；質(zhì)粒空載體對照組（CCl4（＋）K組，n＝15）。采用四氯化碳復(fù)合法制備肝纖維化動物模型。采用脂質(zhì)體包埋法分別將leptin－siRNA重組質(zhì)粒及pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒各100ug通過腹腔注射導(dǎo)入大鼠肝纖維化模型。L組采用leptin－siRNApcDNA3.1（＋）質(zhì)粒；空質(zhì)粒對照組給予pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒。同時正常對照組和肝纖維化組腹腔注射0.9% 的生理鹽水。每9天1次至第12周，共注射7次。注射前各組重組質(zhì)粒均按比例與脂質(zhì)體Lipofectmine 2000混勻。

2.3 HE染色 于實驗第12周末，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖各組大鼠，取出肝臟組織，各留取少許肝組織放入10%甲醛溶液中固定，制4um石蠟切片，進行 HE染色、苦味酸／酸性品紅染色（VG）和免疫組織化學(xué)染色，其余肝組織投入液氮中快速冷凍后再置入－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肰G染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化：進行肝纖維化的病理形態(tài)學(xué)分級，分級標準參照2000年《病毒性肝炎防治方案》中關(guān)于組織病理學(xué)診斷標準中建議的病理學(xué)診斷分級標準［6］。

2.4 半定量RT－PCR 采用一步法提取肝組織總RNA，并用紫外分光光度計行RNA濃度及純度測定。采用二步法RT－PCR試劑盒對肝組織總RNA進行擴增。leptin引物序列：：Upstream：5＇－GTGCCTATCCACAAAGTCCAGGATG－3 ＇；Downstream： 5 ＇－GCATTCAGGGCTAAGGTCCAACTG T－3＇，擴增片段長度為438bp。GDPDH：Upstream 5’－TCACCACCATGGAGAAGG－3’；Downstream 5’－TGGGAGTTGCTGTTGAAG－3’，擴增片段長度為550bp。加入反應(yīng)體系中的RNA和引物的量每組均相同，按照試劑盒說明書行二步法RT－PCR：第一步將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；第二步行PCR反應(yīng)。Leptin、β－actin退火溫度分別為58℃、63℃、58℃，擴增35個循環(huán)后擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳（見圖1）并以Bio－rad Quantity One凝膠成像系統(tǒng)測定各條帶的灰度值進行定量分析，用β－actin作為內(nèi)參校正上樣量，以相應(yīng)區(qū)帶的灰度值相對于內(nèi)參對照組的倍數(shù)表示（A值）。

2.5 Western blot 將保存－70℃ 冰箱中的各組標本取出，加入9倍體積的0.86% 冷生理鹽水，用玻璃研磨器研磨提取組織蛋白，加入蛋白上樣緩沖液后于沸水中煮沸約8min，冷卻后－70℃凍存?zhèn)溆谩Ｔ贓SDS－PAGE凝膠中進行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，室溫封閉1h，加入I型膠原一抗，以1∶1000濃度孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的山羊抗兔HRP標記的二抗，工作濃度為1∶1000，室溫孵育1h，洗膜后加入顯色劑，X線膠片曝光后觀察結(jié)果（圖2），用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－rad Quantity One測定曝光后條帶的灰度值，用β－actin作為內(nèi)參校正上樣量，以相應(yīng)區(qū)帶的灰度值相對于內(nèi)參對照組的倍數(shù)表示（A值）。

3.統(tǒng)計學(xué)方法

所有結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。多組間的差異比較采用F檢驗。兩組間的比較用t檢驗。等級資料病理形態(tài)學(xué)分級結(jié)果作Ridit分析，P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有意義。

結(jié) 果

1.肝組織病理結(jié)果

實驗過程中正常對照組無大鼠死亡，空質(zhì)粒對照組及肝纖維化組各死亡2只和1只，leptin－siRNA治療組死亡3只。根據(jù)VG染色結(jié)果，對各實驗動物肝組織切片進行肝纖維化的病理形態(tài)學(xué)分級，leptin－siRNA治療組與肝硬化組和空載體組比較，肝纖維化病理學(xué)分級有顯著性差異（P＜0.05，表1，圖1－4）

表1 各組動物肝組織纖維化病理分級Table 1 The pathology classification of liver fibrosis of rats

圖1 N（正常對照組）；圖2 肝纖維化組（cd4組）圖3 質(zhì)?？蛰d體對照組（CCl4（＋）K組）；圖4 leptin－siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（CCl4（＋）L組）Fig.1 normal control group（N group，VG staining of liver）Fig.2 liver fibrosis group（CCl4 group，VG staining of liver）Fig.3 empty vector group（CGl4（＋）K，VG staining of liver）Fig.4 leptin－siRNA group（CCl4（＋）L，VG staining of liver）

2.RT－PCR結(jié)果

RT－PCR結(jié)果顯示：與對照組比，肝纖維化組（CCl4）和質(zhì)?？蛰d體組（CCl4（＋）K）leptin－mRNA含量明顯增高；與肝纖維化組（CCl4）和質(zhì)粒空載體組（CCl4（＋）K）比，leptin－siRNA 轉(zhuǎn)染組可沉默leptin mRNA的表達（P＜0.05，圖5）。

圖5 各實驗組動物肝組織Leptin mRNA表達 N：正常對照組；CCl4：肝纖維化組；CCl4（＋）K：空質(zhì)粒對照組；CCl4（＋）L：leptin－siRNA組；M：DNA markerFig.5 The expression of leptin m RNA in rats liver N：normal group；CCl4：liver fibrosis group；CCl4（＋）K：pcDNA3.1（＋）plasmid control group；CCl4（＋）L ：leptin－siRNA group；M：DNA marker

3.Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示leptin－siRNA重組質(zhì)粒治療組leptin值小于肝纖維化組（CCl4）和質(zhì)?？蛰d體組（CCl4（＋）K）（P＜0.05，表2），collagen type I和STAT3蛋白條帶亮度均明顯低于肝纖維化組（CCl4）和質(zhì)?？蛰d體組（CCl4（＋）K）（P＜0.05，圖6）。以上實驗室均用GAPDH作內(nèi)參照，重復(fù)三次，實驗結(jié)果相似。

表2 Western blot法檢測各試驗組動物肝組織leptin的表達（±s）Table 2 The expression of leptin protein of liver fibrosis of rats by Western blot（±s）

表2 Western blot法檢測各試驗組動物肝組織leptin的表達（±s）Table 2 The expression of leptin protein of liver fibrosis of rats by Western blot（±s）

與正常對照組相比，＃P＜0.05；與空質(zhì)粒組、肝纖維化組相比，＊P＜0.05。＃P＜0.05，compared with the normal control group；＊P＜0.05，compared with the empty vector group，liver fibrosis group.

組別（group） 例數(shù)（N） leptin（A值）N 15 134.17621±8.125 CCl4＃ 14 210.3113±6.412 CCl4（＋）K＃ 13 198.4123±5.124 CCl4（＋）L＃＊ 12 160.1241±10.123合計 Asymp.Sig.＜0.05 54 Chi－Square＝48.124 df＝5

圖6 leptin－siRNA抑制I型膠原和STAT3蛋白表達。Western blot法檢測各試驗組動物肝組織I型膠原（6A）和STAT3（6B）的表達。使用灰度比值法測定I型膠原（6C）和STAT3（6D）的表達。與空質(zhì)粒組、肝纖維化組相比，＊P＜0.05。Fig.6 leptin－siRNA inhibits type I collagen and STAT3 protein.Western blots performed using antidodies recognising I collagen（6A）and STAT3（6B）are shown..The ratio of type I collagen（6C）and STAT3（6D）was determined using band densitometry.Result show mean±SE of the three independent studies。＊P＜0.05 relative to negative control siRNA.

討 論

肝纖維化發(fā)生的主要機制是細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成與降解失衡，導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過量沉積。肝硬化目前雖尚無有效藥物可將其逆轉(zhuǎn)甚至治愈，但目前證實肝纖維化是可逆的過程［7］。參與肝纖維化的形成與發(fā)展的過程中涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細胞因子［8］。近年來發(fā)現(xiàn)leptin在多種組織如胃、腎、肝等都有表達［9，10］。有研究發(fā)現(xiàn)，硫乙醇胺（thioacetamide，TAA）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型中，體內(nèi)活化的肝星狀細胞均可以表達瘦素，，而且瘦素可增加肝纖維化和前膠原穩(wěn)態(tài)mRNA的表達。leptin信號傳導(dǎo)主要涉及JAK2／STAT3 來 調(diào) 控 靶 基 因 轉(zhuǎn) 錄［11］。RNA 干 擾（RNAi）是用來有目的地關(guān)閉特定基因的表達。具有自我擴增性，能夠在細胞間傳代，甚至將效應(yīng)傳到下一代，是封閉靶基因的最佳選擇。

研究應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)，針對leptin構(gòu)建leptin－siRNA／pcDNA3.1（＋）真核細胞表達質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染 HSC－T6（hepatic stellate cell，HSC）細胞株，結(jié)果顯示leptin－siRNA／pc DNA3.1（＋）真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，外源性leptin基因可有效轉(zhuǎn)染HSC，并使leptin mRNA和蛋白表達水平顯著提高，HSC的分化及增殖減少［12］。之后制備肝硬化模型鼠并重組質(zhì)粒導(dǎo)入導(dǎo)入各組模型中，肝組織病理顯示）肝纖維化程度減輕，纖維化程度多為Ⅰ－Ⅱ級；Westerblot實驗結(jié)果顯示leptin－siRNA導(dǎo)入組的leptin、I型膠原和STAT3蛋白量同空載體對照組和肝纖維化組相比明顯下降。RT－PCR結(jié)果也證實leptin－siRNA導(dǎo)入組的leptin的mRNA同空載體對照組和肝纖維化組相比明顯降低。上述結(jié)果提示leptin－siRNA導(dǎo)入可抑制leptin、I型膠原和STAT3蛋白表達。

Leptin－siRNA導(dǎo)入肝纖維化鼠體內(nèi)后，leptin、STAT3蛋白和mRNA表達明顯降低，其原因可能是leptin－siRNA導(dǎo)入大鼠體內(nèi)后，通過Ob－R配體與Ob－Rb結(jié)合，通過JAK2／STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)leptin基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗檢測STAT3含量減少，JAK2／STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達降低，目的基因leptin轉(zhuǎn)錄也減少。Karen和Bjorbaek等［13，14］采用免疫沉淀、細胞培養(yǎng)、Weston Blot發(fā)現(xiàn)leptin可以刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白p－STAT3和leptin在中樞和卵巢等外周組織的表達，從而增加肝纖維化。另外肝纖維化時ECM過多沉積，其中膠原是最重要的ECM，肝臟膠原以I、III型為主。當Leptin－siRNA導(dǎo)入肝纖維化鼠體內(nèi)后，I型膠原含量明顯抑制，可有效增強對ECM的降解能力，使沉積相對減少，肝纖維化得以在一定程度上逆轉(zhuǎn)。

總之，leptin在肝纖維化發(fā)展中起到重要的促進作用，利用RNA干擾技術(shù)將leptin－siRNA導(dǎo)入肝纖維化的鼠體內(nèi)阻斷了JAK2／STAT信號通路所致，降低leptin蛋白表達，減輕肝纖維化，為以lepin為靶點的肝纖維化的基因治療提供理論依據(jù)。

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