承澤農(nóng) 武世伍 周 蕾 俞 嵐 宋文慶

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽233030）

肺癌是世界第一大腫瘤［1］，而肺鱗狀細(xì)胞（lung squamous cell carcinoma，LSCC）是肺癌中最主要的類型。LSCC患者5年生存率很低，術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)放化療抵抗是其主要原因。目前認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中可能存在一小群會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及抵抗放化療、并具有自我更新、無限增殖能力的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）。CD44是CSCs的一種標(biāo)記物，同時(shí)也是一種細(xì)胞黏附分子，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附，并介導(dǎo)細(xì)胞生長、分化及死亡等功能。CD44分子的異常表達(dá)，與許多惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。maspin是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、黏附、運(yùn)動(dòng)以及血管生成等功能［2－3］。誘導(dǎo)血管生成是惡性腫瘤增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移所必須具備的能力之一，而反映血管生成能力的一個(gè)指標(biāo)即微血管密度（microvessel density，MVD），與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)116例LSCC患者中CD44、maspin和CD34蛋白的表達(dá)，分析CD44、maspin蛋白表達(dá)以及MVD之間的相互關(guān)系，并探討它們與LSCC浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

材料和方法

1.一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2003年1月—2005年4月存檔石蠟包埋LSCC組織標(biāo)本116例（術(shù)前均未行放、化療）和正常肺組織標(biāo)本30例，所有病例均有完整的臨床病理資料及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2011年4月，隨訪時(shí)間為8－94個(gè)月（中位時(shí)間為41.8個(gè)月）。本實(shí)驗(yàn)是經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)行的。男性103例，女性13例；中央型97例，周圍型19例；腫瘤最大徑＜3.0cm的9例，≥3.0cm的107例；高分化17例，中分化71例，差分化28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有47例，無轉(zhuǎn)移有69例；根據(jù)AJCC2010版分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中I＋I(xiàn)I期患者有58例，III＋I(xiàn)V期患者有58例。年齡34－82歲，中位年齡60.4歲。

對(duì)照組30例正常肺組織均取自距癌旁＞5.0cm的肺組織，并經(jīng)病理H＆E染色證實(shí)為正常肺組織。

2.試劑

鼠抗人maspin（克隆號(hào)EAW24）單克隆抗體購自Lab Vision公司，鼠抗人CD44（克隆號(hào)DF1485）和CD34（克隆號(hào) QBEnd／10）單克隆抗體，ElivisionTMplus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3.石蠟包埋

組織以4μm后連續(xù)切片、烤干，然后在二甲苯溶液及濃度梯度乙醇溶液中脫蠟至水洗。免疫組織化學(xué)操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，采用已知陽性片作對(duì)照，以PBS液替代一抗作空白對(duì)照。最后用蘇木素淡染細(xì)胞核、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水透明，中性樹膠封片。

4.免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

CD44和CD34均以細(xì)胞膜或漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；maspin以細(xì)胞核或漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。MVD通過CD34陽性的小管狀結(jié)構(gòu)來計(jì)數(shù)，方法參考修正的 Weidner法［4］。免疫組織化學(xué)結(jié)果參考文獻(xiàn)［5］所記載的方法進(jìn)行，最后用染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比的得分乘積作為判斷結(jié)果，若積分≤1為陰性，＞1為陽性。每例標(biāo)本均隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（×400倍），免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位病理醫(yī)生采用獨(dú)立雙盲法閱片判定。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。CD44與maspin蛋白表達(dá)與MVD（因MVD計(jì)數(shù)的中位值為20.9，故以MVD≥21為陽性，＜21為陰性）陽性組與陰性組生存分析采用Kaplan－Meier法，組間比較用Log－rank檢驗(yàn)；多因素分析采用Cox回歸模型分析；在LSCC組織中，CD44和maspin蛋白的表達(dá)以及MVD計(jì)數(shù)與正常肺組織以及各臨床病理因素的關(guān)系采用Χ2、Spearman等級(jí)相關(guān)以及t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.LSCC組織中CD44蛋白的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系

CD44蛋白在正常肺組織中的陽性表達(dá)率為10.0%，在LSCC組織中的陽性表達(dá)率為60.3%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD44蛋白的陽性表達(dá)率在LSCC患者的不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小等之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著LSCC組織的分化越差，CD44蛋白的陽性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且CD44蛋白的陽性表達(dá)率在不同臨床分期及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖1A及表1）。

2.LSCC組織中maspin蛋白的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系

maspin蛋白在正常肺組織中的陽性表達(dá)率為100%，在LSCC組織中的陽性表達(dá)率為39.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著LSCC組織的分化越差、臨床分期越高，maspin蛋白的陽性表達(dá)率越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的maspin蛋白陽性表達(dá)率低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。maspin蛋白的陽性表達(dá)率在不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小等之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖1B及表1）。

3.LSCC組織中MVD計(jì)數(shù)及其與臨床病理因素的關(guān)系

隨著LSCC組織的分化越差、臨床分期越高，MVD計(jì)數(shù)就越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的MVD計(jì)數(shù)明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MVD計(jì)數(shù)在不同年齡、性別、腫瘤位置及腫瘤大小之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖1B及表2）。

4.LSCC組織中CD44、maspin、MVD計(jì)數(shù)三者之間的相互關(guān)系

在CD44蛋白陽性表達(dá)組，MVD計(jì)數(shù)的均值為26.9±12.3，在CD44蛋白陰性表達(dá)組，MVD計(jì)數(shù)的均值為11.9±8.8，CD44蛋白表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.609，P＜0.001）；在 maspin蛋白陽性表達(dá)組，MVD計(jì)數(shù)的均值為11.0±7.1，maspin蛋白陰性表達(dá)組，MVD計(jì)數(shù)的均值為27.5±12.2，即maspin蛋白表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝－0.661，P＜0.001）；CD44蛋白表達(dá)與maspin蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝－0.640，P＜0.001）（見表3）。

5.生存及Cox回歸分析

Kaplan－Meier生存分析顯示：CD44蛋白陽性表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯低于其陰性表達(dá)組患者（P＜0.001，見圖2A）；maspin蛋白陽性表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯高于其陰性表達(dá)組患者（P＜0.001，見圖2B）；MVD≥21組患者的生存時(shí)間明顯低于MVD＜21組患者（P＜0.001，見圖2C）。Cox回歸分析顯示：CD44、maspin蛋白表達(dá)與TNM分期均是LSCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05，見表4）。

圖1 LSCC中CD44、maspin蛋白的表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)A：CD44蛋白在LSCC中的陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜和漿（中分化，Elivision×100）B：maspin蛋白在LSCC中的陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞漿和和（中分化，Elivision×400）C：在LSCC中的MVD計(jì)數(shù)（中分化，Elivision×100）Fig.1 Expression of CD44 and maspin and the score of MVD in LSCCA：positive staining of CD44 in membrane and cytoplasm of LSCC（moderately grade，Elivision×100）B：positive staining of maspin in nuclei and cytoplasm of LSCC（moderately grade，Elivision×100）C：the score of MVD in LSCC（moderately grade，Elivision×100）

圖2 CD44和maspin表達(dá)陽性組與陰性組及MVD≥21組與＜21組LSCC患者生存曲線A：CD44蛋白表達(dá)陽性組與陰性組患者生存曲線B：maspin蛋白表達(dá)陽性組與陰性組患者生存曲線C：MVD≥21組與＜21組患者生存曲線Fig.2 Survival curves of LSCC patients with positive or negative expression of CD44，maspin protein，and MVD scoreA：Survival curves of positive or negative CD44 expressionB：Survival curves of positive or negative maspin expressionC：Survival curves of MVD≥21 group or＜21 group

表1 LSCC中CD44和maspin蛋白的表達(dá)與臨床病理因素之間的相互關(guān)系Table 1 Correlation of CD44 and maspin protein expression with clinicopathologic characteristics in LSCC

表2 LSCC中MVD計(jì)數(shù)與臨床病理因素之間的關(guān)系Table 2 Correlation between the scores of MVD and clinicopathological characteristics in LSCC

表3 LSCC組織中CD44和maspin蛋白表達(dá)以及MVD計(jì)數(shù)之間的相互關(guān)系Table 3 the expression of CD44 and maspin protein and the scores of MVD and their relationship in LSCC

表4 116例LSCC患者多因素分析Table 4 Multivariate survival analysis of 116 patients with LSCC

討 論

近年來的研究證實(shí)，在肺癌腫瘤細(xì)胞中可能存在著一些具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞（CSCs）［6－7］，CSCs的 存 在 可 能 是 造 成 腫 瘤 無 限 增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的最主要原因，并被認(rèn)為具有遺傳性［8］。目前，可以通過細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物來分離和純化肺癌CSCs，常用的干細(xì)胞標(biāo)志物有CD44、乙醛脫氫酶、CD133和Lgr5，已被用于識(shí)別正常細(xì)胞 和 CSCs［6，9－11］。CD44 為 細(xì) 胞 表 面 黏 附 分子，可與透明質(zhì)酸特異性結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附、血管形成以及腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LSCC組織中CD44蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在116例LSCC組織中，CD44蛋白的陽性表達(dá)率為60.3%，其表達(dá)率明顯比對(duì)照組的表達(dá)率高，且CD44蛋白的陽性表達(dá)率在LSCC患者腫瘤組織的不同分化級(jí)別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床分期高低之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即CD44蛋白陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞分化差、易于浸潤、轉(zhuǎn)移。生存分析發(fā)現(xiàn)，CD44蛋白陽性表達(dá)組患者生存時(shí)間短。這個(gè)結(jié)果表明，CD44蛋白陽性表達(dá)的患者預(yù)后差，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致［12－13］。

maspin是一種抑癌基因，是Zou等［14］通過消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的，該基因位于人染色體18q21.1－q23，編碼一個(gè)長度42k Da的蛋白，在正常肺上皮細(xì)胞［15］中可以檢測(cè)到其表達(dá)。基因表達(dá)缺失是maspin基因表達(dá)異常的常見形式，在肺癌中也發(fā)現(xiàn)了 maspin基因的表達(dá)缺失［16－17］。maspin基因可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)maspin蛋白在對(duì)照組和LSCC組中表達(dá)是顯著減少的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，maspin蛋白的表達(dá)率與LSCC腫瘤組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床分期高低等密切相關(guān)。生存分析顯示，maspin蛋白陽性表達(dá)組患者的生存時(shí)間明顯高于其陰性表達(dá)組患者。上述結(jié)果表明，隨著maspin蛋白的表達(dá)率越低，LSCC腫瘤組織分化越差、臨床分期越高、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的生存時(shí)間越短，提示maspin的表達(dá)缺失可能會(huì)影響LSCC的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征，隨著腫瘤的快速增殖，就會(huì)發(fā)生缺血和缺氧，為保障其生長，腫瘤細(xì)胞就會(huì)分泌多種誘導(dǎo)血管生成的化學(xué)物質(zhì)從而誘導(dǎo)大量新生血管生成。微血管密度（MVD）是監(jiān)測(cè)血管生成的一個(gè)良好指標(biāo)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，其MVD計(jì)數(shù)顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且MVD計(jì)數(shù)LSCC腫瘤組織的分化程度、臨床分期及生存時(shí)間均密切相關(guān)，即MVD計(jì)數(shù)高的患者生存時(shí)間短、腫瘤組織分化差、臨床分期高。因此，血管生成在腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著極其重要的作用。

對(duì)maspin蛋白與CD44蛋白表達(dá)、MVD計(jì)數(shù)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在癌組織中隨著maspin蛋白表達(dá)率的降低，CD44蛋白的陽性表達(dá)率和MVD計(jì)數(shù)顯著升高，呈負(fù)相關(guān)；而CD44蛋白的陽性表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)之間呈正相關(guān)。提示maspin、CD44以及MVD計(jì)數(shù)之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。CSCs生存的微環(huán)境需要大量新生血管，這樣就會(huì)促進(jìn)腫瘤的快速增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移。正常情況下，maspin可以通過減少與腫瘤相關(guān)的MVD數(shù)量而抑制腫瘤的生長［19］。隨著maspin基因表達(dá)的缺失，喪失了對(duì)血管生成的抑制，導(dǎo)致大量血管生成，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。本研究多因素分析表明CD44和maspin的表達(dá)情況是影響LSCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，CSCs可能是LSCC發(fā)生的根源，血管生成以及maspin的表達(dá)缺失可能進(jìn)一步促進(jìn)LSCC的浸潤、轉(zhuǎn)移。因此，聯(lián)合檢測(cè)CD44和maspin可作為評(píng)估LSCC患者侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)之一。

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