陳貴東 沈 艷 楊 通 黃 薇 梁英杰

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣東511447）

HE染色是病理活檢制片最常用的染色方法，染色質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響讀片和診斷。在HE染色過(guò)程中細(xì)胞核著色淺甚至不著色、組織結(jié)構(gòu)模糊、核質(zhì)對(duì)比不清的現(xiàn)象常常導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行病理診斷。因此，探討一種便捷有效的處理HE染色發(fā)灰的方法具有重要意義。通過(guò)對(duì)10例HE染色細(xì)胞核灰染的胃粘膜、腸息肉和子宮內(nèi)膜等不同類(lèi)型的組織進(jìn)行重新切片，采用多種不同的方法進(jìn)行處理，比較發(fā)現(xiàn)：PBS微波處理法染色效果最佳，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

1.材料

HE染色細(xì)胞核灰染的胃粘膜、腸息肉、子宮內(nèi)膜等共10例，重新切片，厚度0.3um。通過(guò)調(diào)整蘇木素染色條件以及染色前對(duì)組織進(jìn)行修復(fù)處理，進(jìn)行HE染色，比較處理效果。

2.方法

2.1 調(diào)整蘇木素染色條件的方法 具體步驟：（1）切片脫蠟至水。（2）切片分四組處理，A：常規(guī)法（對(duì)照組），室溫下切片浸染蘇木素5min；B：延長(zhǎng)時(shí)間法，室溫下蘇木素染色時(shí)間延長(zhǎng)至2h；C：水浴加熱法，切片置于濕盒內(nèi)放入37℃水浴箱中，蘇木素滴染30min；D：微波加熱法，切片置于耐高溫染色缸內(nèi)，放入格蘭仕P70D20TP－C6（W0）微波爐中調(diào)至中低檔，蘇木素滴染1min。（3）蘇木素染色完畢，依次進(jìn)行分化、返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片，鏡下觀察。

2.2 染色前組織修復(fù)處理的方法 具體步驟：（1）切片脫蠟至水。（2）切片按以下方法處理，①：高壓處理法，分別將切片完全浸入PBS（PH7.2－7.4）、EDTA（PH8.0）和檸檬酸修復(fù)液（PH6.0），用高壓鍋隔水加熱，連續(xù)噴氣3min后自然冷卻；②：微波處理法，分別將切片完全浸入PBS、EDTA和檸檬酸修復(fù)液，放入微波爐中調(diào)至中低檔加熱至沸騰計(jì)時(shí)3min，自然冷卻；③：水煮法，將切片完全浸入雙蒸水中，加熱至沸計(jì)時(shí)5 min，自然冷卻。（3）將對(duì)照片（即未處理）與（2）中各方法處理過(guò)的切片一同水洗后，蘇木素染色5min，依次進(jìn)行分化、返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片，鏡下觀察。

結(jié) 果

1.調(diào)整蘇木素染色條件的染色結(jié)果

常規(guī)法即未調(diào)整蘇木素染色條件的切片灰染現(xiàn)象嚴(yán)重：核染色不良，尤其腺體部位染色淺甚至不著色，呈白霧狀，組織結(jié)構(gòu)模糊不清，紅藍(lán)對(duì)比不鮮明，透明度差。而延長(zhǎng)時(shí)間法、水浴加熱法和微波加熱法均能不同程度地促進(jìn)核染色，蘇木素著色加深，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍不清晰，切片略灰尤其腺體部位發(fā)白，紅藍(lán)對(duì)比和透明度也不夠理想，未能完全達(dá)到閱片診斷的要求。

2.染色前組織修復(fù)處理的染色結(jié)果

水煮法雖能促進(jìn)細(xì)胞核染色但發(fā)灰現(xiàn)象未能完全解決，達(dá)不到閱片診斷的要求。而PBS、EDTA、檸檬酸三種修復(fù)液分別采用高壓處理和微波處理均能較好地改善細(xì)胞核灰染現(xiàn)象。其中以PBS微波處理法效果最佳：組織結(jié)構(gòu)清晰，紅藍(lán)對(duì)比鮮明，核漿染色良好，透明度佳。具體見(jiàn)圖1、2。

圖1 細(xì)胞核灰染的不良染色HE 40×圖2 采用PBS微波法處理 HE 40×Fig.1 poor staining of the nucleus in gray HE 40×Fig.2 treated by PBS and microwave heating HE 40×

討 論

常規(guī)病理活檢制片過(guò)程中出現(xiàn)切片經(jīng)HE染色后細(xì)胞輪廓及核內(nèi)染色質(zhì)、核仁顯示不清發(fā)灰，呈局部或成片淡染發(fā)白，紅藍(lán)對(duì)比不鮮明，透明度差等問(wèn)題屬于灰染現(xiàn)象。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因多且復(fù)雜［1］，根據(jù)HE染色的原理，細(xì)胞核與堿性染料蘇木素相結(jié)合，因此核染色效果差既可能受組織細(xì)胞自身酸堿平衡和帶電狀態(tài)的影響，也可能受蘇木素染色能力的影響。具體而言，其可能的影響因素包括：標(biāo)本離體后固定不及時(shí)導(dǎo)致組織細(xì)胞自溶；固定液及濃度選擇不當(dāng)導(dǎo)致固定不充分；組織脫水不徹底導(dǎo)致發(fā)白發(fā)軟；蘇木素陳舊導(dǎo)致染色能力下降等。本研究所收集到的10例HE灰染的組織來(lái)自不同的處理批次，每一例灰染的組織與同批次的其他標(biāo)本均在相同的條件下進(jìn)行脫水、包埋、切片、染色，但未發(fā)現(xiàn)相同類(lèi)型或其他類(lèi)型的組織有灰染現(xiàn)象。因此，可以排除脫水、浸蠟以及蘇木素染色等環(huán)節(jié)的影響，其最有可能的原因是組織固定不及時(shí)。離體標(biāo)本固定不及時(shí)容易出現(xiàn)組織自溶，從而改變細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的酸堿性質(zhì)和帶電狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞核灰染。

關(guān)于HE染色細(xì)胞核灰染的處理方法有延長(zhǎng)蘇木素染色時(shí)間［2，3］、熱處理［1，4］、加酸處理［5］等。本研究對(duì)各種不同的處理方法進(jìn)行綜合比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）延長(zhǎng)蘇木素染色時(shí)間能夠使細(xì)胞核與蘇木素更充分的結(jié)合，細(xì)胞核染色質(zhì)量有所改善但局部區(qū)域灰白發(fā)霧現(xiàn)象未能徹底解決。（2）水浴加熱法既延長(zhǎng)了染色時(shí)間（30min）又升高了染色溫度（37℃），相比單一延長(zhǎng)蘇木素染色時(shí)間效果更佳，但局部發(fā)灰發(fā)白現(xiàn)象依然存在，核漿對(duì)比不夠鮮明，切片染色略灰。（3）微波加熱法通過(guò)提高分子的運(yùn)動(dòng)速度，增加細(xì)胞的滲透性和溶劑分子的穿透力［6］，提高蘇木素染色能力，但由于微波加熱時(shí)蘇木素滴染容易出現(xiàn)干涸而導(dǎo)致染色不均，整體染色效果未能完全達(dá)到閱片要求。如果能夠控制好微波加熱的溫度和時(shí)間，同時(shí)采用蘇木素浸染可能效果會(huì)進(jìn)一步改善。（4）PBS、EDTA、檸檬酸修復(fù)液分別通過(guò)高壓和微波處理均能不同程度地改善細(xì)胞核灰染現(xiàn)象，尤其是PBS微波處理法效果最好。PBS微波處理法有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是PBS相比EDTA和檸檬酸更好地提供了一個(gè)PH適中的緩沖水環(huán)境，使組織細(xì)胞內(nèi)的酸、堿性物質(zhì)部分恢復(fù)或接近原帶電荷狀態(tài)［7］，促進(jìn)與染色基團(tuán)的結(jié)合，使核漿染色更接近原來(lái)的水平。二是微波處理相比高壓處理更溫和，能夠產(chǎn)生均勻的熱效應(yīng)，使組織細(xì)胞間隙增大，有利于染料分子的穿透吸附。（5）水煮法因PH環(huán)境不如PBS緩沖液，沸騰水煮的熱效應(yīng)也不如微波處理而且更容易掉片，因此染色效果相對(duì)較差。綜上所述，通過(guò)調(diào)整蘇木素染色條件以及染色前對(duì)組織進(jìn)行修復(fù)處理能夠促進(jìn)細(xì)胞核染色，但對(duì)灰染現(xiàn)象的改善程度不一，以PBS微波處理法效果最佳。

HE染色細(xì)胞核灰染現(xiàn)象在日常病理制片過(guò)程中難免發(fā)生，其影響因素眾多，及時(shí)有效地做好固定、取材、脫水、浸蠟、切片、染色等環(huán)節(jié)的工作并加強(qiáng)質(zhì)控管理，是預(yù)防該現(xiàn)象的關(guān)鍵。

［1］田玉旺，李琳，朱紅艷等.熱處理法在常規(guī)HE染色發(fā)灰組織切片中的應(yīng)用.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25（2）：221－222

［2］孫曉榮，陳宇.HE染色細(xì)胞核發(fā)灰的補(bǔ)救處理，齊魯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2005，16（4）：68

［3］冷永梅，黃曉南，鄧永江.HE染色細(xì)胞核發(fā)灰的處理方法.診斷病理學(xué)雜志，2000，7（4）：305

［4］劉慕嫦，羅祝泉.醫(yī)用微波儀在防止病理切片HE染色發(fā)灰現(xiàn)象的應(yīng)用.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志，2000，6（4）：314

［5］印永祥，陸以農(nóng)，陳萍倩.組織切片加酸處理消除組織“發(fā)灰”現(xiàn)象.實(shí)用醫(yī)技雜志，2005，12（1）：262－263

［6］龍建洲.光波－微波技術(shù)在常規(guī)HE染色中的應(yīng)用.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，6（21）：1858－1859

［7］汪曉軍，高凌云.一種處理HE染色細(xì)胞核灰染的新方法.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27（11）：1253－1254