張長(zhǎng)春 陸泉秀 周新社 鮑正齊 胡建國(guó) 丁 海 許 剛 周建生＊

（1安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，蚌埠233004；2安徽省組織移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠233004）

目前通過(guò)手術(shù)方式對(duì)滑脫椎體進(jìn)行復(fù)位和椎間融合是治療腰椎滑脫的最終方法。但國(guó)內(nèi)外有學(xué)者認(rèn)為［1，2］，對(duì)于Ⅰ和Ⅱ度的腰椎滑脫只需要原位脊柱融合即可，對(duì)I度滑脫復(fù)位反而易引起并發(fā)癥。而手術(shù)進(jìn)行脊柱融合不僅創(chuàng)傷大，治療費(fèi)用高，而且術(shù)中使用的融合材料，包括自體骨、異體骨和人工骨等都存在著各種不足。臨床病例研究發(fā)現(xiàn)某些椎間盤(pán)組織鈣化，可以形成高密度的骨組織［3］。而通過(guò)微創(chuàng)技術(shù)人工誘導(dǎo)椎間盤(pán)組織使其鈣化，則有希望達(dá)到椎體融合的目的。因此，本研究通過(guò)建立家兔椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，研究重組人生長(zhǎng)分化因子－5（recombinant human growth differentiation factor－5，rh GDF－5）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對(duì)髓核細(xì)胞成骨潛能的激發(fā)作用。

材料和方法

1.試劑與儀器

rh GDF－5（Peprotech公司，美國(guó)），bFGF（Peprotech公司，美國(guó)），鼠抗人I型膠原抗體、鼠抗人Ⅱ型膠原抗體（Chemicon公司），Envissin＋TM Peroxidase Rabbit（DAKO公司），MTT試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），骨鈣素放射免疫檢測(cè)試劑盒（北京東亞免疫技術(shù)研究所），磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

2.髓核細(xì)胞的提取和培養(yǎng)

取健康成年家兔4只，無(wú)菌條件下取出兔胸腰段脊柱，仔細(xì)分離出椎間盤(pán)髓核組織，剪碎至1 mm3，經(jīng)0.1%Ⅱ型膠原酶消化后離心、重懸兩次，得到髓核細(xì)胞后0.4%臺(tái)盼蘭染色并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力（細(xì)胞活力＝未被染色活細(xì)胞數(shù)量÷細(xì)胞總數(shù)×100%），得到高成活率、成份均一的椎間盤(pán)髓核細(xì)胞。用差速貼壁法純化細(xì)胞，得到純度更高的髓核細(xì)胞。按1×105／ml密度將細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含15%胎牛血清的DMEM，青霉素100 U／ml、鏈霉素100 U／l，待細(xì)胞貼壁后每3 d進(jìn)行傳代，收集，倒置顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況。

3.實(shí)驗(yàn)分組

取上述第三代細(xì)胞，按細(xì)胞因子不同分為四個(gè)培養(yǎng)組：A組（對(duì)照組）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基；B組（rh GDF－5）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基＋rh GDF－5（0.1μg／ml）；C組（bFGF）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基＋bFGF（10 ng／ml）；D 組（rh GDF－5＋bFGF）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基＋rhGDF－5（0.1μg／ml）＋bFGF（10 ng／ml）。

4.Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色

取第三代細(xì)胞爬片后PBS洗片，4%多聚甲醛固定10 min后3%H2O2、10%正常山羊血清室溫依次孵育10min，傾去血清先后滴加一抗（4℃過(guò)夜），二抗，DBA顯色，沖洗后復(fù)染、封片。設(shè)置陰性對(duì)照（不加一抗，其余步驟相同）。

各組細(xì)胞培養(yǎng)至第24 d分別行Ⅰ型、II型膠原蛋白免疫組化染色（按試劑盒步驟進(jìn)行）。前者用鼠抗人I型膠原抗體為一抗，后者用鼠抗人II型膠原抗體為一抗。

5.Ⅰ型膠原免疫印跡（Western blot）

將上述處理后的各組細(xì)胞，迅速冰上勻漿、沸煮10 min，超聲后BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。按照溴酚藍(lán)：β－巰基乙醇＝1∶3的比例充分混合、震蕩、煮沸10 min。將預(yù)染maker和各組樣品依次加入相應(yīng)泳道進(jìn)行電泳，待目的蛋白分離后、緩慢的由SDS－PAGE膠轉(zhuǎn)至NC膜上轉(zhuǎn)膜、3－5%脫脂奶粉室溫封閉30－60 min、一抗孵育（4℃過(guò)夜）、TBS漂洗3次×10 min、二抗室溫下避光孵育1－2 h、TBS漂洗3次×10 min，Odyssey顯色儀顯色分析。

6.放射免疫技術(shù)測(cè)定骨鈣素表達(dá)

各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 d后取上清液，加入分離劑后，混勻室溫放置20 min，4℃3500 r／min離心20 min，吸棄上清液，檢測(cè)沉淀物放射劑量。由放射免疫γ計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)參數(shù)及樣品濃度，單位以ng／ml表示。按表1依次進(jìn)行。

表1 BGP放射免疫技術(shù)加液程序（μl）Table 1 Feeding program of BGP radio－immunity technology（μl）

7.四環(huán)素標(biāo)記鈣結(jié)節(jié)及茜素紅染色比較鈣鹽沉積程度

各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 d時(shí)，將其分別在含有1 mg／ml四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，更換正常DMEM／15%FBS培養(yǎng)基再培養(yǎng)1 h，然后用PBS洗滌，95%乙醇脫水后熒光顯微鏡觀察；各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 d時(shí)，95%乙醇固定后，0.1%茜素紅染色，雙蒸水沖洗后，倒置顯微鏡觀察比較各組鈣鹽沉積情況。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，對(duì)各組總體方差進(jìn)行齊性檢驗(yàn)，用單因素方差分析確定各組均數(shù)間是否有差異，以P＜0.05為差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色

Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色胞漿呈黃褐色定義為陽(yáng)性，結(jié)果顯示對(duì)照組和rhGDF－5組細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陰性（圖1A和B）；bFGF組和rh GDF－5＋bFGF組細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽(yáng)性（圖1C和D）。四組細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陰性。

2.Ⅰ型膠原免疫印跡（Western blot）

免疫印跡結(jié)果顯示：對(duì)照組（Vector）和rh GDF－5組細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平顯著低于bFGF組和rhGDF－5＋bFGF組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白免疫印跡結(jié)果。A.對(duì)照組（Vector）和rh GDF－5組細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平顯著低于bFGF組和rhGDF－5＋bFGF組，DM1A（α－tublin）為內(nèi)參。B.Ⅰ型膠原蛋白／內(nèi)參DM1A后圖灰度值的統(tǒng)計(jì)圖（＊P＜0.05，＊＊P＜0.05和Vector組比較）。Fig.2 Result of CollagenⅠexpressed in each group.A.The expression level of CollagenⅠprotein in Vector and rh GDF－5 group is lower than that in bFGFand rhGDF－5＋bFGFgroup.The levels of CollagenⅠwas standardized against the level of the DM1A （α－tublin）protein.B.Blot of CollagenⅠ／DM1A protein（＊P＜0.05，＊＊P＜0.05 versus Vector group）.

3.骨鈣素表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

bFGF組細(xì)胞分泌的骨鈣素檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比較無(wú)顯著差異。rhGDF－5組和rhGDF－5＋bFGF組細(xì)胞分泌的骨鈣素量均明顯高于對(duì)照組（表2）。

表2 第24 d各組細(xì)胞上清液中骨鈣素測(cè)定結(jié)果（ng／ml）Table 2 Osteocalcin detection in the supernate after 24 days＇cultivation

4.四環(huán)素標(biāo)記鈣結(jié)節(jié)

對(duì)照組和bFGF組均未見(jiàn)明顯熒光標(biāo)記的鈣結(jié)節(jié)；rh GDF－5組和rh GDF－5＋bFGF組可見(jiàn)明顯的熒光鈣結(jié)節(jié)，形狀以圓形為主，伴有少數(shù)不規(guī)則形結(jié)節(jié)。rhGDF－5＋bFGF組鈣結(jié)節(jié)的大小和數(shù)量均明顯高于GDF－5組的鈣結(jié)節(jié)（圖3）。

5.茜素紅染色

對(duì)照組未見(jiàn)鈣鹽沉積；rh GDF－5組鈣鹽沉積較A組明顯；bFGF組未見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)，提示無(wú)明顯鈣鹽沉積。實(shí)驗(yàn)組的鈣鹽沉積最為明顯，形成的鈣結(jié)節(jié)無(wú)論在大小和數(shù)量上均要高于其他三組（圖4）。

討 論

髓核細(xì)胞能特異性地合成和分泌大量的Ⅱ型膠原和聚合蛋白，并且堿性磷酸酶活性非常低［4］。由于長(zhǎng)期的缺氧環(huán)境，髓核細(xì)胞缺乏線粒體并富含糖原［5］。體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞有氧呼吸活動(dòng)增強(qiáng)，在有或沒(méi)有誘導(dǎo)因子作用的情況下，其Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陰性，并且細(xì)胞內(nèi)的糖原減少甚至消失、線粒體增多，這些都提示，髓核細(xì)胞出現(xiàn)了向成纖維細(xì)胞反分化的特征［6］。

Ⅰ型膠原作為鈣鹽沉積的基礎(chǔ)，是成骨細(xì)胞合成分泌的特異性膠原蛋白，當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生退變或鈣化時(shí)，髓核細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原會(huì)減少，Ⅰ型膠原明顯增多［7］。而本實(shí)驗(yàn)中，在bFGF的誘導(dǎo)下髓核細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組化呈陽(yáng)性染色，提示髓核細(xì)胞在誘導(dǎo)因子bFGF的作用下出現(xiàn)了轉(zhuǎn)分化，即具有成骨分化的潛能。

GDF－5屬于TGF－β超家族中的新成員，是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的重要生長(zhǎng)因子。很多研究顯示其在體內(nèi)、外均有較強(qiáng)的促進(jìn)髓核細(xì)胞成骨性分化、誘導(dǎo)異位成骨作用［8－11］。Zeng等［11］發(fā)現(xiàn) GDF－5誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞使其表達(dá) OC、Cbfal、ALP和VEGF等增加。從而證實(shí)GDF－5的礦化作用能誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化。Rothamel等［12］研究發(fā)現(xiàn)GDF－5的復(fù)合材料，能促進(jìn)比格犬牙槽脊骨質(zhì)缺損部位的骨組織形成。這些均提示：GDF－5有顯著的礦化作用。

骨鈣素是成骨細(xì)胞分化成熟及基質(zhì)礦化的特異性指標(biāo)；Ⅰ型膠原是成骨細(xì)胞分泌的主要膠原蛋白，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志；鈣鹽沉積則是細(xì)胞礦化作用的主要表 現(xiàn)［13，14］。本實(shí)驗(yàn) 中 B 組 （rh GDF－5）細(xì)胞不論是上清液中骨鈣素表達(dá)還是茜素紅染色顯示鈣鹽的沉積，均要比A組強(qiáng)，且明顯抑制髓核細(xì)胞的增殖，提示rhGDF－5通過(guò)抑制體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的增殖，而誘導(dǎo)其成骨作用；但其并不影響Ⅰ型膠原的表達(dá)。

bFGF具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)軟骨和骨組織損傷修復(fù)及行成、促進(jìn)血管形成等多種生物學(xué)作用［15］。Riew 等［16］發(fā)現(xiàn)bFGF能促使細(xì)胞合成DNA，促進(jìn)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入增殖期，從而能促進(jìn)大多數(shù)源于中胚葉和神經(jīng)外胚葉的細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)敲除bFGF基因可引起骨密度降低，骨成長(zhǎng)遲緩，導(dǎo)致成骨障礙［17］。本實(shí)驗(yàn)中C（bFGF）組細(xì)胞的增殖速度較對(duì)照組rhGDF－5組明顯加快，Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯增強(qiáng)，但骨鈣素表達(dá)較A組細(xì)胞無(wú)顯著差異，茜素紅和四環(huán)素?zé)晒庖参匆?jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)，故可以推測(cè)，bFGF的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖，在誘導(dǎo)細(xì)胞骨化方面并不如rhGDF－5作用明顯。

成骨誘導(dǎo)和骨形成是一個(gè)復(fù)雜而又連續(xù)的過(guò)程，許多細(xì)胞因子通過(guò)不同方式在不同環(huán)節(jié)上影響不同時(shí)期的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝［18，19］。GDF－5和bFGF通過(guò)不同的途徑和不同的機(jī)理作用于椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，誘導(dǎo)髓核細(xì)胞成骨分化。GDF－5可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)鈣鹽沉積形成鈣結(jié)節(jié)，但同時(shí)阻礙了細(xì)胞的增殖。bFGF能使細(xì)胞DNA合成量增加，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。但其誘導(dǎo)髓核細(xì)胞成骨能力明顯不足。所以，當(dāng)聯(lián)合使用GDF－5和bFGF時(shí)，GDF－5誘導(dǎo)細(xì)胞成骨后，為bFGF提供了大量的靶細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化。bFGF彌補(bǔ)了DGF－5促細(xì)胞增殖能力上的不足，而GDF－5彌補(bǔ)了bFGF成骨誘導(dǎo)活性底下的缺點(diǎn)，使兩者在誘導(dǎo)髓核細(xì)胞成骨的生物學(xué)功能上形成互補(bǔ)，加速了成骨誘導(dǎo)和骨形成的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中rh GDF－5＋bFGF組的骨鈣素表達(dá)最高、Ⅰ型膠原免疫組化的強(qiáng)陽(yáng)性、明顯的鈣鹽沉積都說(shuō)明了GDF－5和bFGF有協(xié)同誘導(dǎo)髓核細(xì)胞成骨的能力。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1 髓核細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組化陰性（A，B）和陽(yáng)性（C，D箭頭所示）染色（×100）（A：A組；B：B組；C：C組；D：D組）。

圖3 四環(huán)素標(biāo)記的鈣鹽陰性（A，C）和陽(yáng)性（B，D箭頭所示）沉積（×200）。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。

圖4 茜素紅染色的鈣鹽（A，C）和陽(yáng)性（B，D箭頭所示）沉積（×200）。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Negative（A，B）and positive（C，D）staining of typeⅠcollagen in the nucleus pulposus cells in each group by immunohistochemistry staining（×100）（A：group A；B：group B；C：group C；D：group D）.

Fig.3 Negative（A and C）and positive（B and D）calcium deposition in each group by tetracycline marker staning（×200）.A：group A；B：group B；C：group C；D：group D.

Fig.4 Negative（A，C）and positive（B，D）calcium deposition in each group by alizarin red staining（×200）.A：group A；B：group B；C：group C；D：group D.