李桂娥，吳小芹

（南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

磷是植物生長發(fā)育所必須的第二大元素，植物所需的磷素營養(yǎng)主要來源于根際土壤。土壤中P主要由無機(jī)磷和有機(jī)磷兩大部分組成，其總含量在0.02%～0.2% (P2O50. 05%～0. 46% )之間。調(diào)查顯示，在全球土壤中，有機(jī)磷含量約占總磷含量的50%，在牧草土壤中甚至高達(dá)80%[1]。在中國土壤中，植酸類磷以及它們與金屬離子形成的各種形式的衍生物（植酸鹽）是土壤中有機(jī)磷的主要存在形式，其含量占總有機(jī)磷含量的20%～60%，對土壤肥力和植物營養(yǎng)有重要的影響[2]。而這部分有機(jī)磷必須在酶的作用下礦化降解成無機(jī)磷才能被植物吸收利用，是植物可利用磷的重要來源[3-4]。在該過程中，植酸酶發(fā)揮著重要作用。事實(shí)上，土壤中絕大部分的植酸酶都來源于土壤微生物，微生物是土壤有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化者。從植物根際或者根際土壤中分離得到的部分微生物，能夠分泌胞外植酸酶降解不同類型的植酸鹽，這已得到證實(shí)[5-7]。

水拉恩氏菌Rahnella aquatilisJZ-GX1，是前期從馬尾松根際土壤中篩選獲得的高效植酸鹽降解菌株，經(jīng)測定具有較高的植酸酶活性，并且能夠顯著促進(jìn)楊樹和馬尾松的生長[8]。植酸酶作用的主要特點(diǎn)是催化效率高，具有高度的專一性，但酶活性易受到多種因素的調(diào)節(jié)控制，例如溫度、pH和金屬離子等，致使酶活性不夠穩(wěn)定，因此對水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸酶酶學(xué)特性進(jìn)行研究，是進(jìn)一步闡明植酸酶的作用機(jī)理，以及開發(fā)應(yīng)用植酸鹽降解微生物于生產(chǎn)實(shí)踐的必要過程。本研究對高效植酸鹽降解細(xì)菌水拉恩氏菌JZ-GX1所產(chǎn)植酸酶在細(xì)胞內(nèi)外的定域表達(dá)及酶學(xué)特性進(jìn)行研究，探討該菌株所產(chǎn)植酸酶的最適反應(yīng)溫度和pH及其在不同溫度和pH環(huán)境下的穩(wěn)定性。旨在探究水拉恩氏菌JZ-GX1菌株的最佳酶促反應(yīng)條件，為其將來作為微生物解磷菌肥的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究所用菌株水拉恩氏菌（R. aquatilis）JZ-GX1，分離自廣西林科院馬尾松林根際土壤，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為NO：M 2012439。經(jīng)測定該菌株具有較高的植酸酶活性[8]。

1.2 細(xì)菌細(xì)胞不同部位植酸酶液提取

將菌株JZ-GX1在NA平板（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4）上活化后，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基（植酸鈣4 g，葡萄糖10 g， MgCl25 g， KCl 0.2 g，MgSO40.25 g，（NH4）2SO40.1 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4），置于搖床上振蕩培養(yǎng)72 h（180 r/min，28℃），搖培后的細(xì)菌培養(yǎng)液待用。細(xì)菌不同部位植酸酶提取方法參照楚曉娜等人的研究方法[9]，略有修改。主要提取程序如下：

（1）細(xì)胞外酶提?。喝∨囵B(yǎng)好的細(xì)菌菌液50 mL，以5 000 r/min離心（4℃），取上清液，即得S1。將沉淀P1重懸于醋酸緩沖液（0.2 M，pH 5.5），混勻后于5 000 r/min離心（4℃），收獲上清S2。合并Sl，S2得到胞外酶。

（2）細(xì)胞間質(zhì)酶提?。涸賹⒊恋鞵2重懸于滲透休克的蔗糖溶液中，混勻，冰浴30 min，后于8 000 r/min離心10 min（4℃），收獲上清得S3。將沉淀P3重懸于10 mL冰水中，混勻，冰浴20 min，8 000 r/min離心10 min（4℃），收獲上清S4，合并S3和S4即為細(xì)胞間質(zhì)酶。

（3）胞內(nèi)酶提?。簩⒊恋鞵4重懸于10 mL醋酸緩沖液中（0.2 M，pH 5.5），混勻后，超聲波破碎細(xì)胞：60%功率，超聲波2 s，停3 s，破碎細(xì)胞總體時(shí)間15 min。8 000 r/min離心l0 min（4℃），收獲上清S5即得胞內(nèi)酶。分別測定各部位的酶活和蛋白含量，通過比較各部位的酶比活力，定位酶在細(xì)胞中的分布情況。

1.3 細(xì)菌細(xì)胞各部位植酸酶活性測定

植酸酶活性測定程序參照彭遠(yuǎn)義的釩鉬酸銨法[10]，稍加改動。植酸酶活性計(jì)算主要是通過測定降解植酸鹽釋放出的無機(jī)磷的含量。取1 mL植酸鈉濃度為1 mM的醋酸緩沖液（0.2 M，pH 5.5 ），加入2 mL細(xì)胞各部位的植酸酶提取液或者植酸酶粗酶液（2 mL滅菌蒸餾水作為對照），于37℃下保溫反應(yīng)30 min后，加入兩滴10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，然后加入2 mL顯色劑，每個處理3個重復(fù)，測定反應(yīng)體系中無機(jī)磷的含量。植酸酶酶活性單位(U)定義為：在一定條件下(37℃、pH值2.5或5.5)，每分鐘從植酸鈉溶液中釋放出1 μmol無機(jī)磷所需要的酶量為一個酶活單位，用U表示。

1.4 待測樣品的蛋白質(zhì)濃度測定

吸取待測液 1 mL（做3次重復(fù)），分別放入具塞試管中，加入考馬斯亮藍(lán) G-250 試劑 4 mL，搖勻，放置 2 min后以標(biāo)準(zhǔn)曲線 1 號管作為空白，在 595 nm 波長下比色，用分光光度計(jì)（Thermo Spectronic HEλIOSγ，Waltham，Massachusetts，USA）測定吸光度值OD595。將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。植酸酶比活力為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用U/mg蛋白質(zhì)表示。

1.5 pH值對植酸酶活力的影響和植酸酶pH值穩(wěn)定性檢測

配制pH值3.8、4.8、5.5、5.8的0.2 M醋酸緩沖液和pH值7.0、8.0的0.l mol/L Tris-HCI緩沖液，在不同pH值的緩沖液中測定植酸酶粗酶液的酶活力，獲得植酸酶相對活力——pH值曲線。

分別配制不同pH值的緩沖液，pH值范圍為1.0～11.0，梯度為1，將植酸酶粗酶液加入到不同pH值緩沖液中，37℃保溫處理30 min，再調(diào)pH值至5.5，測定酶的殘留活性。

1.6 反應(yīng)溫度對植酸酶活性的影響和植酸酶熱穩(wěn)定性檢測

在0.2M醋酸緩沖液（pH值5.5）中，于20、30、37、50、60、70、80℃水浴中進(jìn)行酶反應(yīng)，測定植酸酶粗酶液的活力，制作溫度——活力曲線。

將植酸酶粗酶液在不同溫度下（37、50、70、80℃）分別保溫一定時(shí)間（10、20、40、60、80、100、120 min），再在37℃測定殘留酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)（每個處理至少3個重復(fù)）以表示。用SPSS（SPSS Version 18.0, SPSS Inc.）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey’s HSD檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，顯著性水平a為0.01，概率P值小于顯著性水平，則認(rèn)為存在顯著差異，用Exce（lMicrosoft Excel 2007）制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 水拉恩氏菌JZ-GX1 植酸酶的定域分析

分別獲得水拉恩氏菌JZ-GX1發(fā)酵液的上清液、胞間質(zhì)和胞內(nèi)提取物，以植酸鈉為底物，測定各部位提取物中的植酸酶活性和蛋白含量，并計(jì)算各提取物的植酸酶比活力，結(jié)果如表1所示。由表1可知，JZ-GX1菌株胞外、胞間質(zhì)和胞內(nèi)的植酸酶比活力存在極顯著的差異，胞外酶提取液的比活力顯著大于胞內(nèi)和胞間質(zhì)提取液，分別是胞間質(zhì)和胞外酶活力的1 669倍、12 518倍。這表明該菌產(chǎn)生的植酸酶主要分泌到細(xì)胞外，為胞外酶，只有少部分留在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間質(zhì)，所以直接將該菌的培養(yǎng)液離心收取上清液，即可得到植酸酶粗酶液。

表1 水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶在細(xì)胞內(nèi)的定域?Table 1 Phytase position of Rahnella aquatilis JZ-GX1

2.2 pH值對水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶活力的影響

一般情況下，酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著，pH值對水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸酶活性的影響見圖1，從圖可知，當(dāng)pH值＜5.5時(shí)，植酸酶的活性隨著pH值的升高而升高，植酸酶的最適pH值為5.5左右，當(dāng)pH值大于7.5時(shí)酶活性下降較快，該菌所產(chǎn)植酸酶為酸性植酸酶。

圖1 pH對水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶活性的影響Fig.1 Effects of pH on phytase activity of Rahnella aquatilis JZ-GX1

2.3 水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶pH值穩(wěn)定性

水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸酶在不同pH值下保溫處理30 min后，再在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定植酸酶活性，植酸酶pH值穩(wěn)定性如圖2所示。結(jié)果表明，在pH值3.0～7.0的范圍內(nèi)，植酸酶相對活性維持在75%以上，而pH值高于7.0時(shí)酶相對活性迅速下降，當(dāng)pH值為11.0時(shí)已無酶活性，這說明該菌所產(chǎn)植酸酶具有較好的耐酸特性，但是不耐堿。2

圖2 水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶pH穩(wěn)定性Fig.2 pH stability of phytase of Rahnella aquatilis JZ-GX1

.4 溫度對水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶活性的影響

酶的催化作用都受溫度的影響，在最適溫度下，酶的活力最高，反應(yīng)速度也最快。反應(yīng)溫度對植酸酶活性的影響見圖3，從圖中可知植酸酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃左右，當(dāng)反應(yīng)溫度在30 ℃和50 ℃之間時(shí)，提取液的植酸酶活性較明顯，但當(dāng)溫度上升到70 ℃以上時(shí)，酶活性下降較快。

2.5 水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶的熱穩(wěn)定性

圖3 溫度對水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶活性的影響Fig.3 Effects of temperature on phytase activity of Rahnella aquatilis JZ-GX1

圖4 水拉恩氏菌JZ-GX1植酸酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Heat stability of phytase secreted by Rahnella aquatilis JZ-GX1

水拉恩氏菌所產(chǎn)植酸酶的熱穩(wěn)定性如圖4所示，結(jié)果表明，當(dāng)處理溫度為80 ℃時(shí)，保溫處理10 min后，酶活性喪失50%左右，60 min時(shí)酶活性已完全喪失；70 ℃下，保溫處理10 min后，同樣酶活性下降50%左右，而酶活性維持時(shí)間延長至90 min；當(dāng)保溫溫度為50 ℃時(shí)，處理90 min后，酶活性仍可以保持65%以上，具有較好的熱穩(wěn)定性，37 ℃下保溫120 min后，酶活性基本沒有損失。

3 結(jié)論與討論

植酸鹽是土壤有機(jī)磷存在的主要形式，由于這部分磷極其難溶，所以對植物生長基本是無效的，但若經(jīng)微生物酶降解，便可被植物吸收利用。植酸酶是一種能高效降解植酸鹽的酶類，其在土壤中主要來源于微生物，微生物植酸酶降解植酸鹽具有生物催化的特色，其作用效果和催化反應(yīng)速率受所處環(huán)境的影響。掌握微生物分泌植酸酶的主要部位和其酶促反應(yīng)的最適pH、最適溫度，以及其對pH和溫度的穩(wěn)定性等酶學(xué)主要特性，有助于更好地利用產(chǎn)植酸酶微生物。

微生物酶可以在活細(xì)胞內(nèi)起催化作用，也可以透過細(xì)胞膜作用細(xì)胞外的物質(zhì)，前者稱胞內(nèi)酶，后者稱胞外酶。水拉恩氏菌JZ-GX1培養(yǎng)液離心后的上清液植酸酶比活力是最高的，分別是胞間質(zhì)和胞內(nèi)酶比活力的1 669倍、12 518倍，這表明，菌株JZ-GX1產(chǎn)生的植酸酶為胞外酶，主要分泌到細(xì)胞外起作用。這一結(jié)果為植酸酶粗酶液的提取提供了依據(jù)，即可通過培養(yǎng)液離心直接獲得粗酶液；同時(shí)這對于微生物菌肥利用而言這是非常有利的，為其能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供了極大的便利和可能。

微生物酶的活性受環(huán)境條件的影響十分顯著，不同來源的植酸酶反應(yīng)對最適環(huán)境因子的要求差異較大，主要的物理環(huán)境條件有：溫度、pH值等。相關(guān)研究指出：植酸酶的最適pH值一般在2.0～8.0之間，植物來源的植酸酶最適pH值4.0～7.5，大多數(shù)在5.0～6.0，細(xì)菌來源的植酸酶最適pH值為4.0～8.0，真菌來源的植酸酶最適pH值為2.5～7.0[11]。不同來源的植酸酶的最適溫度差異較大。從嗜溫微生物Aspergillus terreus和Myceliophthora thermopHila 等分離到的高溫植酸酶最適溫度在70～80 ℃，有較好的耐熱性，但在37℃時(shí)的活性卻很低[12-14]。文章對水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸酶反應(yīng)的最適pH和最適溫度進(jìn)行，結(jié)果表明JZ-GX1菌株所產(chǎn)植酸酶為酸性植酸酶，最適pH為5.5，具有一定的耐酸性，但不耐堿；最適溫度為37℃，當(dāng)溫度小于50℃時(shí)，該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。因此為使由該菌制備的菌肥發(fā)揮最大的促生功效，應(yīng)盡量避免在低溫的冬季及pH較高的鹽堿土壤施用。

微生物菌肥在野外的應(yīng)用，受到許多環(huán)境因子的影響，要使其在野外應(yīng)用時(shí)也表現(xiàn)出與實(shí)驗(yàn)室一樣的促生效果則必須充分掌握其促生所需的最適環(huán)境，尤其是以微生物酶調(diào)節(jié)為主的促生效應(yīng)。本研究為水拉恩氏菌JZ-GX1將來作為微生物菌肥應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)，提供了重要的參考依據(jù)。

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