周 毅 任國敏 楊聰慧 任春霞 孟慶鵬

DNA 甲基化是指通過化學(xué)修飾在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S -腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基(-CH3)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核昔酸胞嘧啶的5＇位碳原子上，導(dǎo)致5 -甲基胞嘧啶的形成［1］。腫瘤抑制基因CpG 島相關(guān)啟動子的基因特異性DNA 甲基化是眾多人類腫瘤標(biāo)志物［2-3］。多個(gè)腫瘤抑制基因的甲基化涉及白血病，淋巴瘤和骨髓瘤的信號通路的失調(diào)，由此表明腫瘤抑制基因的甲基化在血液癌癥發(fā)病機(jī)制中的重要性［4-6］。值得注意的是，腫瘤抑制基因DNA 甲基化在慢性淋巴細(xì)胞性白血病的發(fā)病或預(yù)后中發(fā)揮作用［7］。慢性淋巴細(xì)胞白血病是歐美成人最常見的白血病類型，我國較少見，為主要源于B 淋巴細(xì)胞的單克隆性小淋巴細(xì)胞疾病［8］。在本實(shí)驗(yàn)中，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)技術(shù)研究了miR -9 -3 的甲基化，旨在確定其在慢性淋巴細(xì)胞性白血病的致病作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

慢性淋巴細(xì)胞性白血病共78 例，均來自內(nèi)蒙古牙克石市人民醫(yī)院。男51 例(65.4%)，女27 例(34.6%)，年齡37～91 歲，平均年齡65.0 歲，經(jīng)診斷符合白血病FAB 國際診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均為新診斷且未接受過放化療、誘導(dǎo)分化及骨髓移植等特殊治療。采集肝素抗凝骨髓1 ～2 ml/份，收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞，于-80℃保存。8 例正常供髓者單個(gè)核細(xì)胞設(shè)為對照組(取自健康志愿者外周血B 細(xì)胞CD19，N =3;取自健康志愿者外周血血漿，N =2;取自健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，N=3)。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng)

人類白血病細(xì)胞株CLL-AAT、MEC1、MEC2、I83 -E95、WAC3CD5 +、HG3 和232B4 由內(nèi)蒙古牙克石市人民醫(yī)院血液病科贈送。細(xì)胞分別保存在含有10%胎牛血清的RPMll640 營養(yǎng)培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml 和鏈霉素100 ug/ml)，置于320%O2、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每48 ～72 h 用含有0.02%EDTA、0.01%胰蛋白酶的消化液消化后，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)

按照QIAampDNAMini Kit(QIAGEN，Germany)的操作步驟結(jié)合DNA/RNA 提取儀(QIAcube)輸入程序即可快速抽提78 例慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者骨髓標(biāo)本和7 種慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株DNA，同樣方法提取8 例正常對照提取DNA。每個(gè)樣品用兩組引物，其中一個(gè)針對修飾的甲基化DNA(M)，另一個(gè)是針對修飾的未甲基化DNA(U)。重亞硫酸氫鹽處理:加入新鮮配制的20 mmol /L 氫醌12.6 ul 和4.8 mol/L 亞硫酸氫鈉(pH =5.0)320 ul，PCR 儀上進(jìn)行下面循環(huán):55 ℃15 min，95 ℃30 s，一共20 個(gè)循環(huán)。以EZ DNA Methylation kit 對基因組DNA 進(jìn)行修飾。修飾后的DNA 溶解于20 ul 的M-Elution Buffer，反應(yīng)產(chǎn)物在20g/L 的瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4 MSP 測序

首先應(yīng)用亞硫酸鈉對DNA 進(jìn)行化學(xué)修飾，并用作模板，MSP 檢測miR -9 -3 基因啟動子區(qū)DNA 序列。將DNA 中所有未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化成為胸嘧啶(T)，但有甲基化修飾的C 經(jīng)亞硫酸鈉處理后仍保持為C。該步驟應(yīng)用EpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN，Germany)，按照說明書完成。使用PSQ 檢測設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。正向引物:5＇ -GAAGGGGGTTGGGATTTGA -3＇;反向引物:5＇ - ATTTCTCCCCTACTCCCC-3＇。

1.5 5 -氮雜-2＇ -脫氧胞苷(5 -AzaDc)處理

取細(xì)胞在對數(shù)生長期的I83 -E95 和WAC3CD5 +細(xì)胞株，按照1 ×106個(gè)細(xì)胞/ml 的密度接種于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)。用終濃度為0.5 uM 的5 -AzaDc 處理，每24 h 更換新鮮的5 -AzadC，在第0 天和第5 天分別收獲細(xì)胞。

1.6 Western blot 檢測NF-κB1

I83 -E9548 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞。加入RIPA裂解液(50 mM 的Tris -HCl，pH =7.4，150 mM 氯化鈉，0.2%SDS，1%TritonX-100，2 mM EDTA)，Bradford 法測定蛋白濃度，取20 ug 蛋白，進(jìn)行10%SDS -PAGE 電泳。電泳完畢后，PAGE 膠上的蛋白用Bio -Rad 微型電轉(zhuǎn)移至0.2 um 的硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜加入NF -κB1，4℃下孵育24 h，然后將膜洗滌，加入抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗，室溫下反應(yīng)1 h 洗膜，曝光，X -膠片經(jīng)顯影、定影后掃描記錄。以Anti-actin 為內(nèi)對照。

2 結(jié)果

2.1 慢性淋巴細(xì)胞性白血病miR-9 -3 的MSP 結(jié)果

78 例慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中65 例miR-9 -3 甲基化，MSP 陽性率為83%(見圖1);所有8 例正常對照組(N1至N8)miR-9 -3 全部呈未甲基化狀態(tài)(見圖2);7 種慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株miR -9 -3 甲基化表達(dá)譜顯示:I83 -E95 和WAC3CD5 +細(xì)胞株顯示miR -9 -3 完全甲基化，232B4，CLL-AAT 和HG3 部分甲基化，而MEC1 和MEC2完全未甲基化(見圖3)。miR -9 -3MSP 產(chǎn)物序列分析顯示，與miR-9 -3 原序列相比，除了甲基化的C 外，所有的C均被轉(zhuǎn)化為T，而CpG 位點(diǎn)中被甲基化的C 未被轉(zhuǎn)化。說明我們的轉(zhuǎn)化方案不僅是高效的，也是特異的(見圖4)。

圖1 慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者的miR-9 -3MSP 結(jié)果

圖2 對照組的miR-9 -3MSP 結(jié)果

2.2 5 -AzaDc 對miR-9 -3 甲基化程度的影響

結(jié)果表明，處理前I83 -E95 和WAC3CD5 +細(xì)胞株miR-9 -3 呈甲基化狀態(tài)，而用5 -AzaDc 處理后，I83 -E95 和WAC3CD5 +細(xì)胞株miR-9 -3 呈未甲基化狀態(tài)。

圖3 慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株的miR-9 -3MSP 結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)染miR-9 -3 對I83 -E9548 細(xì)胞株NF -κB1 蛋白水平的影響

I83-E9548 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染48h 后收集細(xì)胞，提取細(xì)泡的蛋白，采用用Western blot 法來比較各組細(xì)胞內(nèi)NF -κB1 蛋白P105 和P50 的含量。轉(zhuǎn)染miR -9 - 3 后NF - κB1 蛋白P105/50 表達(dá)水平降低。如圖6 所示，miR -9 -3 組與對照組相比NF-κB1 蛋白水平降低。

圖4 miR-9 -3 基因啟動子區(qū)DNA 序列MSP 測序結(jié)果

圖5 5 -AzadC 對I83 -E95 和WAC3CD5 +細(xì)胞株治療作用

圖6 I83 -E9548 細(xì)胞株NF-κB1 蛋白水平的變化

3 討論

成熟的microRNA(miRNA)是一類長度約21 -25nt 的真核生物內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，它在細(xì)胞內(nèi)通過堿基互補(bǔ)與相應(yīng)的信使RNA(mRNA)的3’- 非編碼區(qū)(3’-URT)結(jié)合，使其降解或抑制其翻譯，在細(xì)胞的分化、增生、凋亡、個(gè)體發(fā)育及機(jī)體代謝中起著重要作用［9］，其功能是抑制其靶蛋白的表達(dá)［10］。在癌變過程中，miRNA 可分為致癌基因和抑癌基因的miRNA［9］。最近研究表明，癌癥患者抑癌基因的miRNA 異常DNA 甲基化沉默。以往的研究還確定一些抑癌基因的miRNA 甲基化參與慢性淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)病，其中包括了miR -203，miR -124 -1，miR -181a/b，miR-107 和miR-424［10］。

在人類中，有三個(gè)獨(dú)立的miR-9 基因(miR -9 -1 位于1 號染色體上;miR-9 -2 位于5 號染色體上;miR -9 -3 也位于5 號染色體上)具有相同的miR -9 序列。miR -9 即可以是致癌基因的miRNA 也可以是抑癌基因的miRNA，取決于癌癥或組織類型［11］。例如，miR -9 過表達(dá)已被證明能提高乳腺癌細(xì)胞或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移或侵襲，表現(xiàn)為致癌作用，反之，miR-9 通過結(jié)合于3＇非翻譯區(qū)(3＇非編碼區(qū))的NF-κB1 的mRNA，抑制NFκB1 翻譯卵巢腫瘤細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞增殖，因此表現(xiàn)出腫瘤抑制功能。本實(shí)驗(yàn)主要研究miR-9 獨(dú)立基因之一miR-9 -3 的甲基化。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在I83 -E95 細(xì)胞株miR -9 -3 完全甲基化導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少并且增強(qiáng)凋亡。

I83 -E95 和WAC3CD5 +細(xì)胞株處理前二者均呈高甲基化狀態(tài)，而5 -AzadC 處理后都發(fā)生脫甲基化，呈未甲基化狀態(tài)。這些都說明5 -AzaDc 具有誘導(dǎo)miR-9 -3 去甲基化的能力，這種能力可能與5 -AzaD 降低了miR -9 -3 表達(dá)有關(guān)。有人認(rèn)為5 -AzaDc 作用機(jī)制是先與靶基因結(jié)合，再與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，形成一個(gè)不可逆的復(fù)合體，從而阻斷甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。

有研究表明［12］，miR-9 -3 可以通過調(diào)控NF -κB1 蛋白抑制慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的生長，miR -9 -3 在慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞中是低表達(dá)的，而增加miR -9 -3可以抑制細(xì)胞的體外生長，另外miR -9 -3 直接作用于NF-κB1 的3’UTR 區(qū)，說明NF -κB1 是慢性淋巴細(xì)胞性白血病中miR-9 -3 的重要的靶點(diǎn)，當(dāng)miR -9 -3 高表達(dá)時(shí)NF-κB1 的mRNA 和蛋白都被抑制。在慢性淋巴細(xì)胞性白血病中是否也存在這種相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過減弱或抑制miR-9 -3 的表達(dá)，觀察其對慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞NF -κB1 的表達(dá)，為下一步慢性淋巴細(xì)胞性白血病的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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