蔣玲麗，王雪亮，肖艷群，王華梁

(上海市臨床檢驗(yàn)中心，200126)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是目前國(guó)內(nèi)乙型肝炎病毒(HBV)檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的方法。臨床對(duì)HBV患者體內(nèi)病毒復(fù)制水平或臨床抗病毒治療效果判斷普遍憑借臨床經(jīng)驗(yàn)，HBV DNA降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)被認(rèn)為抗病毒治療有效，但這種經(jīng)驗(yàn)方法缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，1個(gè)可靠的檢測(cè)結(jié)果還必須依賴不確定度為臨床提供準(zhǔn)確的參考[1]。測(cè)量不確定度代表測(cè)量結(jié)果的分散性，是1個(gè)反映測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)。近年來(lái)，不確定度概念逐漸引入臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。不確定度通?？赏ㄟ^(guò)“模式辦法”和“經(jīng)驗(yàn)辦法[2]”來(lái)評(píng)定。對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，影響檢驗(yàn)結(jié)果或與檢驗(yàn)結(jié)果有關(guān)的因素很多，其測(cè)量不確定度評(píng)定仍存在許多有待澄清的問(wèn)題。臨床實(shí)驗(yàn)室中不確定度的合理評(píng)定和應(yīng)用，仍需要一定的實(shí)踐、探討和一定的約定。本單位承擔(dān)著上海市醫(yī)療結(jié)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量監(jiān)管、指導(dǎo)和服務(wù)職能，探討既簡(jiǎn)便又可信的評(píng)定PCR測(cè)定HBV DNA不確定度方法對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)工作具有借鑒意義。本文參考文獻(xiàn)[3]采用“經(jīng)驗(yàn)辦法”對(duì)實(shí)驗(yàn)室的HBV DNA項(xiàng)目測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)定，探討其可行性。

材料和方法

一、材料

1.檢測(cè)儀器 瑞士Roche公司的lightcycler實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀、杭州博日HB-100型恒溫金屬浴、德國(guó)Biofuge-Fresc O高速冷凍離心機(jī)。

2.檢測(cè)試劑 上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20111212。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。

3.樣品 取2例臨床確診乙型肝炎患者血清，用于批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取上海市地區(qū)性室內(nèi)質(zhì)控品2個(gè)濃度，批號(hào)1201，用于批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

二、方法

1.測(cè)量不確定度的評(píng)定程序 利用實(shí)驗(yàn)室提供的方法學(xué)性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)評(píng)定A類不確定度，分別用參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)組織的HBV DNA室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)評(píng)定B類不確定度;本研究中所有不確定度分量全部采用標(biāo)準(zhǔn)不確定度(即標(biāo)準(zhǔn)差)表示;分別評(píng)定測(cè)量觀測(cè)值個(gè)數(shù)n=1、2、3 3種情況下的合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。

2.不確定度A類評(píng)定 實(shí)驗(yàn)室可提供的方法性能參數(shù)包括批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。(1)批內(nèi)重復(fù)性分析:以不同濃度水平的2例乙型肝炎患者血清標(biāo)本，重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算2個(gè)濃度水平的批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差[s(w)];由批內(nèi)重復(fù)性引起的不確定度為測(cè)量觀測(cè)值個(gè)數(shù);(2)批間重復(fù)性分析:根據(jù)HBV DNA室內(nèi)質(zhì)控物高低2個(gè)濃度2012年23批次室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，分別求得2個(gè)濃度水平的批間標(biāo)準(zhǔn)差[s(b)];由批間重復(fù)性引起的不確定度。

3.不確定度B類評(píng)定 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)。根據(jù)本室參加2012年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和CAP HBV DNA室間質(zhì)評(píng)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)結(jié)果與靶值的差值(dn)，計(jì)算差值的平均值(dm)及其標(biāo)準(zhǔn)差由 u(bias)的大小來(lái)估計(jì)由方法偏倚(系統(tǒng)效應(yīng))導(dǎo)致的不確定度。另外，由于超出測(cè)定范圍樣品稀釋導(dǎo)致的不確定度亦歸不確定度B類統(tǒng)計(jì)，樣品稀釋檢測(cè)不在本研究范圍。

4.合成不確定度和擴(kuò)展不確定度的評(píng)定根據(jù)公式確定合成不確定度擴(kuò)展不確定度(U)為uc乘以包含因子(k)，取P=95%置信區(qū)間時(shí)

5.每次實(shí)驗(yàn)均做室內(nèi)質(zhì)控，當(dāng)質(zhì)控結(jié)果在控時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才能采用，否則，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)均將初始濃度值QDNA進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)GQ后計(jì)算。統(tǒng)計(jì)結(jié)果小數(shù)點(diǎn)后保留4位有效數(shù)字。

結(jié) 果

一、PCR測(cè)定HBV DNA 2種濃度水平，計(jì)算由批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性導(dǎo)致的不確定度分量見(jiàn)表1。

表1 批內(nèi)和批間重復(fù)性引起的不確定度分量

二、PCR測(cè)定HBV DNA，通過(guò)2012年參加的衛(wèi)生部和CAP反饋的室間數(shù)據(jù)，計(jì)算由方法偏倚因素引起的不確定度結(jié)果見(jiàn)表2。

三、PCR測(cè)定HBV DNA合成不確定度與擴(kuò)展不確定度評(píng)定。見(jiàn)表3和表4。

討 論

由7個(gè)國(guó)際著名學(xué)術(shù)組織頒布的在計(jì)量學(xué)上有深遠(yuǎn)影響的標(biāo)準(zhǔn)“測(cè)量不確定度表示導(dǎo)則(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，簡(jiǎn)稱GUM)”，對(duì)測(cè)量不確定度評(píng)定與表示的一般規(guī)則作出了規(guī)定和說(shuō)明[4]。用于實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)主要是ISO17025和ISO15189，中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)等同采用這些標(biāo)準(zhǔn)(CNAS-CL01和CNAS-CL02)，用于中國(guó)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可。2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均要求測(cè)量結(jié)果的不確定度。隨著實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的逐漸推廣，不確定度概念逐漸引入醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。PCR是目前國(guó)內(nèi)HBV DNA檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的方法。在臨床應(yīng)用中，同一實(shí)驗(yàn)室不同檢測(cè)批次間或不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的差異，已成為困擾臨床醫(yī)師、患者及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的普遍問(wèn)題。臨床醫(yī)生提出檢測(cè)結(jié)果的不一致究竟是患者病毒載量的真正變化還是由檢測(cè)系統(tǒng)本身引起的差異，應(yīng)該加以辨別。臨床實(shí)驗(yàn)室必須在充分了解PCR測(cè)定的不確定性的基礎(chǔ)上，采取相應(yīng)質(zhì)控措施，才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而不致出現(xiàn)判斷失誤。

表2 方法偏倚不確定度

表3 合成不確定度與擴(kuò)展不確定度(衛(wèi)生部室間數(shù)據(jù)評(píng)定)

表4 合成不確定度與擴(kuò)展不確定度(CAP室間數(shù)據(jù)評(píng)定)

目前國(guó)內(nèi)PCR測(cè)定主要依靠手工進(jìn)行核酸提取，整個(gè)操作步驟繁多。有國(guó)內(nèi)學(xué)者指出PCR測(cè)定HBV DNA的不確定度來(lái)源包括:模板制備過(guò)程中的標(biāo)本濃縮和核酸提取來(lái)源的不確定度、擴(kuò)增反應(yīng)體系來(lái)源的不確定度、數(shù)據(jù)處理的不確定度、相關(guān)儀器設(shè)備(如熱循環(huán)儀和移液器等)的不確定度[5]。根據(jù)不確定度來(lái)源計(jì)算每一組分的不確定度，稱為“模式辦法”;對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，不易掌握[6]，在實(shí)際的應(yīng)用過(guò)程中也不可行。國(guó)內(nèi)有學(xué)者提出簡(jiǎn)化的不確定度來(lái)源計(jì)算方式，即“經(jīng)驗(yàn)辦法”，以此制定符合臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作的不確定度評(píng)定方法[2，7]。我們實(shí)驗(yàn)室采用“經(jīng)驗(yàn)辦法”對(duì)HBV DNA項(xiàng)目的不確定度評(píng)定進(jìn)行了探討。首先，收集了實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展HBV DNA檢測(cè)項(xiàng)目之前就需完成的批內(nèi)不精密度、批間不精密度等性能驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。通過(guò)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度 A類評(píng)定，本實(shí)驗(yàn)室104～105和106～107U/mL計(jì)算的批內(nèi)不精密度分別為3.13%和1.42%，批間不精密度分別為 4.23% 和 3.52%(未在文中列出)，上海市各醫(yī)療機(jī)構(gòu)的PCR實(shí)驗(yàn)室每月上報(bào)至本中心的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，HBV DNA濃度為104～105和106～107IU/mL，其室內(nèi)質(zhì)控不精密度在3%～5%之間，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室性能驗(yàn)證的數(shù)據(jù)可以接受，代表了目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的不精密度水平。由此評(píng)定的A類不確定度從表1可以看出，在n=1時(shí)HBV DNA的檢測(cè)濃度在104～105和106～107IU/mL時(shí)，評(píng)定得到的u(w)分別為0.136 9 和0.084 3，u(b)分別為0.205 3 和0.236 7;這也和文獻(xiàn)[3]計(jì)算的數(shù)據(jù)比較接近。這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室評(píng)定的A類不確定度和其他實(shí)驗(yàn)室接近。

另外，本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)參加了衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和CAP組織的室間質(zhì)評(píng)，通過(guò)室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)評(píng)定B類不確定度，以此來(lái)估計(jì)由方法偏倚(系統(tǒng)效應(yīng))導(dǎo)致的不確定度。由于室間質(zhì)評(píng)的頻次和數(shù)據(jù)較少，在評(píng)定B類不確定度時(shí)，我們未按檢測(cè)樣品濃度分組統(tǒng)計(jì)。2012年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心共組織2次室間質(zhì)評(píng)，通過(guò)7個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本計(jì)算得到的方法偏倚導(dǎo)致的B類不確定度為0.099 7;2012年CAP組織3次室間質(zhì)評(píng)，通過(guò)5個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本計(jì)算得到的方法偏倚導(dǎo)致的B類不確定度為0.430 8;通過(guò)2個(gè)不同機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)評(píng)定B類不確定度數(shù)據(jù)差異較大。從表3和表4可以看出，當(dāng)HBV DNA的檢測(cè)濃度在104～105和 106～107IU/mL，n=1，k=1.96時(shí)，通過(guò)衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)計(jì)算，其擴(kuò)展不確定度分別為0.521 6和0.529 8;通過(guò)CAP室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)計(jì)算，其擴(kuò)展不確定度分別為0.973 1和0.977 5。同一實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)不同機(jī)構(gòu)的室間數(shù)據(jù)來(lái)源評(píng)定B類不確定度，其得出的擴(kuò)展不確定度竟相差0.451 5～0.447 7。主要原因在于:2個(gè)機(jī)構(gòu)對(duì)HBV DNA項(xiàng)目的評(píng)價(jià)方式不同，CAP組織HBV DNA室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目以方法組的均值作為靶值;衛(wèi)生部臨檢中心采用溯源至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品得出的檢測(cè)值作為靶值，并不對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行分組，而不同品牌試劑檢測(cè)結(jié)果存在較大差異。由此可見(jiàn)，雖然采用“經(jīng)驗(yàn)辦法”評(píng)定 PCR測(cè)定 HBV DNA的不確定度簡(jiǎn)便易行，但采用室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)評(píng)定不能反映實(shí)驗(yàn)室真實(shí)的測(cè)量不確定度。如果使用HBV DNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定B類不確定度，可避免由于評(píng)價(jià)方式的不同造成的B類不確定度的差異。在日常檢驗(yàn)工作中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將極大的改善不同實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果的可比性，從而逐步實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果有條件的互認(rèn)[8]。目前，已有國(guó)內(nèi)學(xué)者[9]提出采用測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定不確定度，并指出在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或不同實(shí)驗(yàn)室間HBV DNA測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較或互認(rèn)時(shí)，引入“不確定度報(bào)告”使結(jié)果具有可比性。上海市臨床檢驗(yàn)中心是上海市衛(wèi)生局授權(quán)開(kāi)展全市醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)管、指導(dǎo)和服務(wù)的技術(shù)支撐單位，對(duì)實(shí)驗(yàn)室不確定度的評(píng)定進(jìn)行探討將對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)工作具有一定借鑒作用。本實(shí)驗(yàn)室將在后續(xù)的研究中采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)，力求尋找一種臨床實(shí)驗(yàn)室既簡(jiǎn)便又可信的評(píng)定PCR測(cè)定HBV DNA的不確定度的方法。

綜上所述，“經(jīng)驗(yàn)辦法”評(píng)定PCR測(cè)定HBV DNA的不確定度雖然簡(jiǎn)便易行，但利用室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)評(píng)定，由于其評(píng)價(jià)方式不同不能準(zhǔn)確真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)室不確定度?？梢赃M(jìn)一步探討采用檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)評(píng)定PCR測(cè)定HBV DNA的不確定度。

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