查成喜，邢福軍，張雪燕，郭 鵬，習 靜，韓躍武

(1.甘肅省中醫(yī)院檢驗科，甘肅蘭州730050;2.蘭州大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所，甘肅蘭州730000)

白血病(leukemia)是起源于骨髓多能造血干細胞的惡性增殖性腫瘤，是十大高發(fā)性腫瘤之一。其中慢性粒細胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)約占各類白血病的20%，占慢性白血病的95%。臨床上CML的診斷主要依靠血象、骨髓象、細胞化學染色以及用流式細胞儀檢測白血病細胞抗原[1-2]。但是血象檢查無特異性;骨髓穿刺具有一定的風險性，且技術要求較高;細胞化學染色結果受影響的因素較多，如試劑、每個實驗人員判斷標準等，使結果相差很大;流式細胞儀檢測價格昂貴，不能作為常規(guī)體檢的項目對白血病進行人群普查[3-4]。我們利用前期建立的高靈敏度、高特異性的K562細胞ssDNA核酸適配子檢測方法(簡稱適配子檢測法)[5-6]檢測臨床白血病患者血液標本，評價該法在臨床CML診斷中的實際應用價值。

材料和方法

一、標本收集及處理

選擇2010年6月至2011年10月首次入院，經(jīng)臨床診斷標準[2]確診的CML患者18例(男10例，女8例，平均年齡35歲)、其他白血病患者22例(男10例，女12例，平均年齡37歲)，另選取同期健康體檢者20名作為正常對照組，男10例，女10例，平均年齡35歲。

二、儀器及試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(日本);Promega鏈霉親和素磁珠及磁力架(Promega公司);洗滌緩沖液:4.5 g/L葡萄糖、5 mmol/L MgCl2·6H2O 溶于含0.1 g/L MgCl2和0.133 g/L CaCl2的磷酸鹽緩沖液(PBS);結合緩沖液:洗滌緩沖液中加入0.1 mg/mL tRNA、1 mg/mL BSA和0.1%疊氮鈉。其它試劑均為分析純，實驗用水均為去離子水。

三、方法

分別采集所有對象靜脈血5 mL，分離粒細胞，－20℃保存?zhèn)溆?。按照構建的檢測體系的相關參數(shù)[6]，分別與上述36例血樣1×106個中性粒細胞37℃黑暗環(huán)境孵育，用結合緩沖液洗滌，上磁力架，收集沉淀，加入400μL結合緩沖液，即適配子-細胞-適配子復合物。用熒光分光光度計測定復合物熒光強度，測定3次，取平均值。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、各組適配子-細胞-適配子復合物的熒光強度比較

所有數(shù)據(jù)分布基本符合正態(tài)分布，95%分布區(qū)間為(463.23，488.71)。CML 組適配子-細胞-適配子復合物熒光強度為492.26±41.67，與其它白血病組(466.86±33.23)及正常對照組(469.33 ±37.13)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P 值分別為0.078、0.243);其它白血病組與正常對照組之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.835)。

二、適配子檢測法對CML診斷價值的評價

適配子檢測法診斷CML的ROC曲線下面積為 0.702，最佳臨界值為 475.13，見圖 1。以適配子-細胞-適配子復合物熒光強度≥475.13為陽性，對CML的診斷結果見表1。靈敏度(Sen)為83.33%、特異性(Spe)為 54.76%、陽線預測值(pv+)為44.11%、陰性預測值(pv－)為88.46%、診斷效率(DE)為 30%、診斷指數(shù)(DI)為138.09%、可用度(DA)為 0.38、可靠度(DR)為0.86、優(yōu)勢比(RP)為6.05。

圖1 適配子檢測法診斷CML的ROC曲線

表1 臨床診斷和適配子檢測法的診斷結果比較

討 論

本研究結果顯示適配子檢測法診斷CML的ROC曲線下面積為 0.702;當最佳臨界值為475.13時，適配子檢測法診斷CML的靈敏度為83.33%、特異性為54.76%;通過ROC曲線結果及與評價指標參考區(qū)間[10]的比較，適配子檢測法對CML臨床診斷具有較低的準確性，實際應用還有一定的局限性，目前還不具備真正的臨床應用價值。我們推測造成該法無臨床應用價值的原因主要有:(1)收集CML標本數(shù)量較少，未能進行大量樣本的檢測，相對容易產(chǎn)生偏倚;(2)所應用的核酸適配子是在前期試驗中以CML K562細胞株為材料，經(jīng)cell-SELEX篩選得到的，雖然甄別K562細胞具有較高的特異性和親和力，但是臨床CML患者血細胞在形態(tài)結構、細胞膜表面物質表達等方面可能具有一定的差異性;(3)收集的血標本放置時間過長，沒有及時處理等原因，造成細胞死亡或形態(tài)結構改變，引起結合熒光強度降低，本研究中適配子檢測法診斷CML的特異性僅為54.76%。

綜上所述，適配子檢測法目前尚不能應用于臨床診斷CML。我們期望通過后續(xù)增加樣本量、進一步加強與臨床合作、重新針對臨床細胞篩選核酸適配子等手段將其真正應用于臨床診斷中，為臨床醫(yī)師診斷腫瘤提供一種更靈敏、更簡便、更經(jīng)濟的檢測方法，為社會和廣大患者做出積極的貢獻。同時，進行有關腫瘤體內(nèi)外分子成像的研究，為腫瘤診斷提供一種新的分子探針技術。

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