張?jiān)迫A,朱井玲,熊安英,單莉婭,朱美意,鄭艷,郝慧星,黃瑾
(新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,石河子 832002)
神經(jīng)系統(tǒng)病變和損傷的治療一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題,目前臨床上多用以神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為主的藥物治理。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化的多肽或蛋白質(zhì),可以為神經(jīng)再生提供良好的微環(huán)境,在防止神經(jīng)細(xì)胞的退變和促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)等方面起著十分重要的作用[1-3]。因此關(guān)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子神經(jīng)再生和防止神經(jīng)元退行性變的應(yīng)用研究一直是研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。Neuritin是一種與神經(jīng)可塑性相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)因子,1993年Nedivi等[4]在谷氨酸類似物紅藻氨酸鹽的誘導(dǎo)下從大鼠海馬齒狀回篩選到CPG15(candidate plasticity-related gene15)。1997年對(duì)CPG15研究顯示,CPG15能夠促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長(zhǎng),故將其命名為 Neuritin[5]。
Neuritin在胚胎發(fā)育期可維持神經(jīng)元存活、抑制凋亡[6],調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞分化、移行和突觸成熟[7];在成年期,能促進(jìn)突起的生長(zhǎng)[5],調(diào)節(jié)突觸回路的形成[8],還介導(dǎo)了學(xué)習(xí)和記憶的突觸重塑過(guò)程,可能是BDNF控制的突觸可塑性和記憶鞏固的效應(yīng)器[9],另外它是一類新發(fā)現(xiàn)的血管生長(zhǎng)因子,并作為潛在的癌癥治療靶點(diǎn)[10]。為獲得大量Neuritin基因工程產(chǎn)物以進(jìn)行生物學(xué)功能的研究,本實(shí)驗(yàn)利用前期構(gòu)建重組GSll5/pPIC9K-Neuritin畢赤酵母工程菌,誘導(dǎo)表達(dá)重組的Neuritin蛋白并進(jìn)行純化和鑒定。
1.1.1 菌株GS115/pPIC9K-Neuritin由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。
1.1.2 儀器與試劑AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)購(gòu)自GE公司;His-Trap Crud親和層析預(yù)裝柱購(gòu)自GE公司;電泳儀購(gòu)自BIO-RAD公司;離心超濾管購(gòu)自Millipore公司。
酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xide公司;酵母氮源(YNB)和 G418均購(gòu)自 Invitrogen公司;YPD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基配方見(jiàn)Invitrogen公司提供的畢赤酵母操作手冊(cè);NC膜購(gòu)自Whatman公司;His抗體和羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Bio-Rad公司;化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)置Pierce公司;透析袋購(gòu)自spectrum labs公司;蛋白分子量marker購(gòu)自Thermo公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。
1.2.1 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取GSll5/pPIC9K-Neuritin工程菌的單克隆菌落,在YPD培養(yǎng)基中30℃ 220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按照1∶50接種于1 L BMGY培養(yǎng)基,30℃ 220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約4 h,5000 r/min離心 5 min, 棄上清,收集菌體重懸于1 L BMMY培養(yǎng)液中,加入終濃度為1%的甲醇。30℃ 220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)72 h,每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為1%。
1.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的鹽析離心誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)液14000 r/min 30 min 4℃,收集上清,用終濃度為65%的硫酸銨飽和沉淀,4℃過(guò)夜。過(guò)夜鹽析后的溶液,14000 r/min 30 min 4℃離心沉淀。
1.2.3 親和層析收集離心沉淀的蛋白,加start buffer溶解,0.22 μm濾器過(guò)濾,純化過(guò)程參考GE Healthcare親和層析純化手冊(cè)。其中start buffer(20 mmol/L sodium phosphate,0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH 7.4),elution buffer (20 mmol/L sodium phosphate,0.5mol/L NaCl,300 mmol/L imidazole,pH7.4), 采用線性梯度洗脫方 法,start buffer 和elution buffer分別以0%~100%的比例進(jìn)柱,即咪唑濃度逐漸增加,分別收集蛋白流出液和洗脫蛋白液,并SDS-PAGE檢測(cè)。
1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定
收集的蛋白行15%SDS-PAGE,恒壓90V100min。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R-250染色。
1.2.5 Western-blot和生物質(zhì)譜檢測(cè)
1.2.5.1 Western-blot檢測(cè) 蛋白經(jīng)SDSPAGE后,23 V,45 min將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上,膜以封閉液封閉過(guò)夜,加入1∶1000稀釋的His抗體,37℃孵育4 h后,洗滌NC膜3次,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(1:50000),37℃孵育2 h,洗滌NC膜3次,最后用ECL顯色曝光。
1.2.5.2 生物質(zhì)譜進(jìn)行分子量和序列分析 純化后的重組Neuritin蛋白制作凍干粉,MALDI-TOFMS由北京毅新興業(yè)科技有限發(fā)展公司完成,獲得Neuritin重組蛋白精確的分子量和肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass finger-priting,PMF)。應(yīng)用 Mascot搜索引擎在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索,結(jié)果的可靠性用序列覆蓋率進(jìn)行分析。
采用線性梯度洗脫,收集蛋白流出液和洗脫蛋白液(圖 1)。
圖1 Neuritin蛋白的親和層析色譜圖Fig.1 Affinity chromatography of Neuritin protein
SDS-PAGE檢測(cè)所收集的蛋白(圖2),分子量大約11 ku,與理論值(包括6個(gè)His插入序列,共計(jì)93個(gè)氨基酸,理論值11.16 ku)相符。
圖2 15﹪SDS-PAGE分析純化的融合蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of identified Neuritin-His fusion protein
純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后,利用His抗體對(duì)該蛋白行免疫印跡分析,由結(jié)果(圖3)可見(jiàn),有與His抗體特異結(jié)合的蛋白條帶,分子量與理論值相符。
圖3 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定結(jié)果Fig.3 Western-blot results of expression products of GS115/pPIC9K-neuritin
MALDI-TOF-MS測(cè)得的Neuritin重組蛋白的分子量結(jié)果見(jiàn)圖4,橫坐標(biāo)顯示質(zhì)量電荷比(m/z),蛋白質(zhì)分子離子化后通過(guò)質(zhì)量分析器對(duì)其質(zhì)量電荷比進(jìn)行分析,結(jié)果得到樣品的精確分子量為10965.6621 u。
圖4 Neuritin重組蛋白的MALDI-TOF-MS分子質(zhì)量質(zhì)譜圖Fig.4 Molecular mass spectrum of Neuritin recombination protein
采用MALDI-TOF-MS,對(duì)酶解后的Neuritin重組蛋白肽段進(jìn)行肽指紋圖譜測(cè)定(圖5)。
圖5 Neuritin重組蛋白的MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜Fig.5 PMF of neuritin recombination protein
應(yīng)用Mascot搜索引擎在SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) 中輸入Neuritin蛋白肽指紋圖譜后檢索肽段序列的覆蓋率。紅色標(biāo)注為匹配片段(圖6),其中HHHHHHAGK為蛋白第 1~9個(gè)氨基酸,LGDSMANYPQGLDDK為蛋白第 24~38個(gè)氨基酸,NLNIQGSLFELCGSG為蛋白第79~93個(gè)氨基酸,總覆蓋率41.9%,提示純化后的蛋白很可能是Neuritin重組蛋白。
圖6 應(yīng)用SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索PMFFig.6 Searcher for PMF in the SwissProt Databas
Neuritin是近年發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,在研究和應(yīng)用前景方面具有較明顯的優(yōu)勢(shì)。首先,Neuritin能促進(jìn)突起生長(zhǎng)[5]、維持神經(jīng)元存活[6]。其次,Neuritin為僅含一條肽鏈的蛋白質(zhì),可以利用基因工程方法制備人源性制品,克服了鼠源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子無(wú)法避免的免疫原性弊端。第三,Neuritin基因工程產(chǎn)品可通過(guò)微生物發(fā)酵大量獲取,利于研究及大規(guī)模應(yīng)用。因此,開(kāi)發(fā)Neuritin基因工程產(chǎn)品,有助于深入挖掘Neuritin功能,為神經(jīng)損傷后的修復(fù)及再生奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展很快的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng),非常適合于真核生物蛋白質(zhì)的表達(dá)。由于該表達(dá)系統(tǒng)有很強(qiáng)的真核蛋白質(zhì)修飾功能,重組蛋白能在菌體內(nèi)得到正確折疊和糖基化修飾,因此廣泛應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品的研制和開(kāi)發(fā)。
本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的GSll5/pPIC9K-Neuritin畢赤酵母工程菌株中,Neuritin的N端插入6個(gè)組氨酸序列。6個(gè)組氨酸作為標(biāo)簽蛋白由于分子量小,一般不影響蛋白的折疊和干擾Neuritin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能;另外Ni2+與6×His融合蛋白的結(jié)合非常有效,因此允許融合蛋白Neuritin-His結(jié)合到Ni2+螯合表面上,操作簡(jiǎn)便快速,有利于蛋白的純化并且在非變性條件下進(jìn)行,保持了目的蛋白的生物學(xué)活性,純化后的Neuritin蛋白可直接用于功能研究,所以本研究選用Ni2+螯合層析進(jìn)行純化。
氨基酸序列覆蓋率分析發(fā)現(xiàn),匹配的序列并不是很多,可能是Neuritin重組蛋白酶解后某些肽段的特征不明顯,不能在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢出。雖然測(cè)得的序列覆蓋率可以說(shuō)明純化的蛋白很可能為Neuritin重組蛋白,但為了進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性,我們將進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定。在目前的情況下,氨基酸全序列測(cè)定仍然比較困難,且費(fèi)用昂貴,因此下一步?jīng)Q定通過(guò)EDMAN降解法測(cè)定純化蛋白的N端和C端序列。
對(duì)Neuritin蛋白純化的研究,可以得到較多較純的Neuritin蛋白,為后續(xù)的關(guān)于神經(jīng)方面的功能研究以及Neuritin蛋白的大規(guī)模純化奠定基礎(chǔ),因此具有很好的意義。
[1]Bonnet D,Garcia M,Vecino E,et al.Brain-derived neurotrophic factor signalling in adult pig retinal ganglion cell neurite regeneration in vitro[J].Brain Research,2004,1007(12):142-151.
[2]Wirenfeldt M,Babcock A A,Ladeby R,et al.Reactive microgliosis engages distinct responses by microglial subpopulations after minor central nervous system injury[J].Neuroscience Research,2005,82(4):507-514.
[3]Lobner D,Ali C.Mechanisms of bFGF and NT-4 potentiation of necrotic neuronal death[J].Brain Research,2002,954(1):42-50.
[4]Nedive E,Hevroni D,Naot D,et al.Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning[J].Nature,1993,363(24):718-722.
[5]Naeve G S,Ramakkrishnan M,Kramer R,et al.Neuritin:a gene induced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis[J].Proc Natl Acad.Sci.USA Neurobiology,1997,94(6):2648-2653.
[6]Putz U,Harwell C,Nedivi E.Soluble CPG15 expressed during early development rescues cortical progenitors from apoptosis[J].Nature Neuroscience,2005,8(3):322-331
[7]Pahnke J,Mix E,Knoblich R,et al.Overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor induces genes regulating migration and differentiation of neuronal progenitor c ells[J].Experiment Cell Research,2004,297(2):484-494.
[8]Di Giovanni S,Faden A I,Yakovlev A,et al.Neuronal plasticity after spinal cord injury:identification of a gene cluster driving neurite outgrowth[J].The FASEB Journal,2005,19(1):153-154.
[9]Wibrand K,Messaoudi E,Havikel B,et al.Identification of genes co-upregulated with Arc during BDNF-induced long-term potentiation in adult rat dentate gyrus in vivo[J].European Journal of Neuroscience,2006,23(6):1501-1511.
[10]Han D,Qin B,Liu G,et al.Characterization of neuritin as a novel angiogenic factor[J].Biochemical and biophysical research communications,2011,415(4):608-612.