王梅，劉曉梅，牛攀新，楚光明

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003）

新疆地區(qū)風(fēng)沙大，自然災(zāi)害嚴(yán)重，為改善農(nóng)區(qū)生態(tài)環(huán)境和保證農(nóng)作物生產(chǎn)安全，營造了大量以楊樹為主的防護(hù)林。由于多種因素的影響，楊樹葉片在生長季常出現(xiàn)發(fā)黃、落葉等現(xiàn)象，呈現(xiàn)夏季“秋景”的景象，既破壞了防護(hù)林的整齊度和視覺效果，還造成防護(hù)林生長衰弱、嚴(yán)重時(shí)甚至枯死，嚴(yán)重威脅著防護(hù)林的防護(hù)效果。

葉片黃化是葉片葉綠素含量減少并衰老的明顯標(biāo)志，葉片黃化引起植物體內(nèi)其他生理生化特征的變化[1]。目前，林木黃化的研究多集中于樟樹、葡萄等景觀經(jīng)濟(jì)樹種的研究[2-3]，針對楊樹黃化的研究主要集中在楊樹黃化苗木葉部氧化酶、葉綠素、生長量以及楊樹黃化原因與防治等方面[4-7]，而對不同黃化等級楊樹生理生化特征的綜合研究較少。植物的各種生理生化指標(biāo)直接反應(yīng)了植物生長狀況的好壞[8-9]，因此,若要了解黃化對樹木生長的影響，就要明確黃化對樹木生長過程中各生理生化指標(biāo)變化的影響。因此，本研究對不同黃化等級俄羅斯楊（Populus Russkii）樹葉片的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，分析各項(xiàng)指標(biāo)與不同黃化等級的關(guān)系，明確黃化對俄羅斯楊生理生化特征的影響，以期為楊樹黃化的防治研究和林業(yè)的發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為克拉瑪依農(nóng)業(yè)開發(fā)區(qū)防護(hù)林中的俄羅斯楊。

露點(diǎn)水勢儀 （HR-33T）（美國WESCOR公司生產(chǎn)），LI-6400便攜式光合儀（美國LICOR公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 黃化等級劃分方法

用葉綠素分析儀（JC503-SPAD502）測量俄羅斯楊葉片的SPAD，將其分為5個(gè)黃化等級（表1）。

表1 俄羅斯楊葉片黃化分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Leaf etiolation grade standard of Populus Russkii

1.2.2 采樣方法

于6月中旬，在克拉瑪依農(nóng)業(yè)開發(fā)區(qū)防護(hù)林中選擇具有代表性的俄羅斯楊黃化樣地1塊，逐株對黃化情況進(jìn)行調(diào)查，按照表1的黃化分級標(biāo)準(zhǔn)對樹木進(jìn)行逐株分級，用葉綠素分析儀確定葉片的黃化等級，每個(gè)等級采集距新梢頂端5 cm處的葉片各10片，將同一病級葉片分別裝入保鮮袋中，用裝有冰塊的保溫桶帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對采集的樣品進(jìn)行清洗并晾干表面水分，對不同黃化等級的葉片組織進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)測定。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測定方法

本研究所有測定方法參照文獻(xiàn)[1 0-1 2]中的方法。

1）水勢測定：用露點(diǎn)水勢儀（HR-33T-R）測定葉片的水勢，每個(gè)黃化等級分別選取3個(gè)葉片，每個(gè)葉片測定3次，7:00-19:00，每隔2 h測1次，共7次。

2）凈光合速率測定：用LI-6400便攜式光合儀測定凈光合速率，每個(gè)黃化等級選取3個(gè)葉片，每個(gè)葉片測定3次，9:00-19:00，每隔2 h測1次，共6次。

3）葉綠素含量測定：采用比色法。

4）丙二醛（MDA）含量的測定：采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法。

5）超氧化物歧化酶（SOD）活性測定：采用NBT光化學(xué)還原法。

6）過氧化物酶（POD）活性測定：采用愈創(chuàng)木酚顯色法。

7）多酚氧化酶（PPO）活性測定：采用兒茶酚法。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS18.0軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用ORIGIN 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃化等級葉片水勢日變化

通過對不同黃化等級的俄羅斯楊葉片水勢的測定結(jié)果（圖1）表明，從早晨到傍晚，Ⅰ～Ⅳ級水勢總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，7:00葉片具有較高的水勢，至 13:00 時(shí)降到最低，分別為-1.04、-0.91、-1.01、1.44 和-1.81 MPa，正常（Ⅰ級）葉片水勢下降最多。Ⅴ級葉片水勢呈持續(xù)下降趨勢，17:00時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)-2.04 MPa。

對于同一時(shí)間來說，葉片的水勢隨著黃化等級的增加而顯著降低，正常（Ⅰ級）葉片水勢最高，Ⅴ級的最低。

圖1 不同黃化等級葉片水勢日變化Fig.1 Diurnal variation of leaf water potential under different etiolation grade

2.2 不同黃化等級葉片凈光合速率的日變化

不同黃化等級的葉片隨著氣溫和光合有效輻射升高，由圖2可見：凈光合速率呈現(xiàn)的變化趨勢為，13:00 時(shí)出現(xiàn)最高峰，Ⅰ級（19.70 μmol/（m2/s））、Ⅱ級（6.47 μmol（/m2/s））、Ⅲ級（4.93 μmol/（m2/s））、Ⅳ級（4.54 μmol/（m2/s））、Ⅴ級（3.42 μmol/（m2/s））；此后下降，15:00時(shí)出現(xiàn)低谷，Ⅰ～Ⅴ級的凈光合速率分 別 占 了 13:00 時(shí) 的 32.64% 、10.53% 、19.07% 、24.53%和34.21%；而后凈光合速率有所回升，17:00時(shí)出現(xiàn)第 2 個(gè)峰值，Ⅰ～Ⅴ級分別為 16.70、3.27、3.25、2.52 和2.17 μmol/m2·s。 說明凈光合速率的日變化有明顯的“午休”現(xiàn)象。在此過程中，正常（Ⅰ級）葉片變化最為明顯，Ⅴ級的凈光合速率變化最小。

對于同一時(shí)間來說，葉片的凈光合速率隨著黃化等級的增加而顯著下降，正常（Ⅰ級）葉片凈光合速率最高，Ⅴ級的最小。

圖2 不同黃化等級葉片凈光合速率日變化Fig.2 Diurnal variation of leaf net photosynthetic rate under different etiolation grade

2.3 不同黃化等級對葉片葉綠素含量的影響

黃化是葉片葉綠素減少所造成的，因此葉綠素含量是植物黃化最為直接的影響因素[13-14]。通過對不同黃化等級葉片葉綠素含量測定結(jié)果（圖3）表明，隨著黃化程度的加重，葉綠素a的含量快速減少，正常（Ⅰ級）的葉綠素a含量為1.40 mg/g，黃化程度最嚴(yán)重Ⅴ級為0.07 mg/g，Ⅴ級含量分別占到Ⅰ級的5.06%。經(jīng)方差分析表明，不同黃化等級葉片葉綠素a 含量差異達(dá)到顯著水平 （F=1199.090，Sig=0.000，P＜0.05）。

圖3 不同黃化等級葉片葉綠素a含量Fig.3 Leaf chlorophyll a content under different etiolation grade

葉綠素b含量與葉綠素a含量一樣，其含量也是隨著黃化程度的加重而顯著下降（圖4），自Ⅰ級的 0.55 mg/g 下降至Ⅴ級的 0.24 mg/g，Ⅴ級含量分別占到Ⅰ級的43.12%。經(jīng)方差分析表明，葉綠素b含量差異極顯著（F=7.931，Sig=0.004，P＜0.01）。

圖4 不同黃化等級葉片葉綠素b含量Fig.4 Leaf chlorophyll b content under different etiolation grade

葉綠素含量隨著黃化程度的加劇，其含量也顯著下降趨勢，自Ⅰ級的1.79 mg/g下降至Ⅴ級的0.14 mg/g，Ⅴ級葉綠素含量為Ⅰ級含量的7.99%，降幅達(dá)到92.01%，葉綠素含量差異極顯著 （F=87.494，Sig=0.000，P＜0.01（圖 5））。

圖5 不同黃化等級葉片葉綠素含量Fig.5 Leaf chlorophyll content under different etiolation grade

對葉綠素含量與黃化等級之間的關(guān)系作模擬曲線（圖6），探討二者之間的聯(lián)系。得到指數(shù)曲線擬合方程為：Y=3.4754e-0.605X，R2=0.979。

圖6 葉綠素含量隨葉片黃化等級模擬曲線Fig.6 Simulation curve of Chlorophyll content and etiolation grade

2.4 不同黃化等級對葉片MDA含量的影響

通過對不同黃化等級的俄羅斯楊葉片中的MDA的含量測定結(jié)果（圖7）表明：黃化葉片除Ⅱ級的 MDA 含量（19.16 μmol/g）高于正常葉片外，其他均低于正常葉片。對5種不同黃化等級葉片的MDA含量進(jìn)行多重比較，Ⅰ、Ⅱ等級之間差異不顯著，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等級之間差異不顯著，Ⅱ、Ⅲ等級之間差異顯著（F=10.628，Sig=0.001，P＜0.01）。

圖7 不同黃化等級葉片MDA含量Fig.7 Leaf MDA content under different leaf etiolation grade

2.5 不同黃化等級對葉片SOD含量的影響

SOD作為清除自由基重要物質(zhì)，關(guān)系著植株抗性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。對不同黃化等級葉片SOD酶含量測定結(jié)果（圖8）顯示，隨著黃化程度的加重，葉片SOD酶活性呈下降趨勢，黃化葉片中SOD均低于正常葉，正常（Ⅰ級）葉片 SOD 含量為 149.08 U/g，Ⅴ級為 54.35 U/g，SOD 酶降低幅度為 36.46%。經(jīng)方差分析表明，SOD酶的含量差異顯著 （F=4.731，Sig=0.021，P＜0.05）。

圖8 不同黃化等級葉片SOD含量Fig.8 Leaf SOD content under different leaf etiolation grade

2.6 不同黃化等級對葉片PPO含量的影響

PPO酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機(jī)械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，使組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。由圖9可見，黃化葉片中的PPO含量呈現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)，正常葉片含量最高，為146.67 U/g·min。經(jīng)方差分析表明，PPO 含量差異不顯著（F=1.578，Sig=0.254，P＞0.05）。

圖9 不同黃化等級葉片PPO含量Fig.9 leaf PPO content under different leaf etiolation grade

2.7 不同黃化等級對葉片POD含量的影響

POD酶與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關(guān)系，其含量的多少直接體現(xiàn)了植株的生長狀況。對不同黃化等級葉片中POD含量的測定結(jié)果（圖10）表明：POD隨等級的加重，其含量也逐漸降低。Ⅳ級（330.67 U/g）、Ⅴ級（260.00 U/g）下降極其明顯。經(jīng)方差分析表明，POD含量差異極顯著（F=23.720，Sig=0.000，P＜0.01）。

2.8 各指標(biāo)與楊樹黃化級別之間的相關(guān)性分析

對黃化等級和各生化指標(biāo)的含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果（表2）表明：各生化指標(biāo)與黃化均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中葉綠素、SOD、POD含量與黃化具有較高的負(fù)相關(guān)性，并達(dá)到顯著水平，即隨著黃化程度的增加其含量逐步減少。

圖10 不同黃化等級葉片POD含量Fig.10 Leaf POD content under different leaf etiolation grade

表2 各生化指標(biāo)與黃化等級之間的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficient of biochemical indexes and tiolation grade

3 結(jié)論與討論

在植物各部位的水勢當(dāng)中，葉片水勢代表植物水分運(yùn)動(dòng)的能量水平，是植物組織水分狀況的直接表現(xiàn)，反映了植物在生長季節(jié)中各種生理的活動(dòng)受環(huán)境水分條件制約的程度[15]。光合效率是估計(jì)植物潛在生產(chǎn)力的重要指標(biāo)[16]。本結(jié)果研究表明，發(fā)生黃化的俄羅斯楊葉水勢和葉片凈光合速率均低于正常葉片，這主要是由于黃化導(dǎo)致葉片組織結(jié)構(gòu)受到破壞，進(jìn)而阻礙了植物水分運(yùn)輸和光合作用的進(jìn)行。

葉綠素的含量減少既是樹木黃化形成的原因，也是黃化對樹木生理影響的原因。葉綠素含量的減少，形成的化學(xué)能也就相應(yīng)減少，當(dāng)黃化程度較嚴(yán)重的時(shí)候，葉片就會出現(xiàn)白化，直至新梢有枯死現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，隨黃化等級的增加，葉片葉綠素a、b和a+b含量均呈下降趨勢。由于受到外界不良環(huán)境的影響，葉片中葉綠素合成受阻，導(dǎo)致葉綠素含量降低。葉綠素含量的大幅下降造成葉片失綠，光合作用受到嚴(yán)重影響，致使植株生長不良。

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的變化可作為衡量逆境脅迫對植物造成氧化損害程度的指標(biāo)，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱。因此，測定植物體內(nèi)MDA的含量，在一定程度上可以判斷逆境對植物的危害程度和植物對逆境的抵抗力[17]。植物受到脅迫后，MDA的含量會隨脅迫程度的增加呈現(xiàn)增加的趨勢[18-19]。而在本研究中，MDA的含量隨黃化等級的加重呈先上升后下降趨勢，主要是由于在黃化發(fā)生的初期，黃化傷害刺激了葉片細(xì)胞中MDA的合成，MDA的含量升高。但隨著黃化的逐步加重，葉片內(nèi)生理代謝不足，生化反應(yīng)難以維持，則MDA合成量也隨之減少。

植物細(xì)胞中SOD、POD酶是主要保護(hù)酶之一，通過清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，阻止氧化損傷[20-21]。本研究表明，黃化的葉片中SOD、POD酶含量隨著黃化等級的逐步加重，其含量隨之下降。這說明葉片黃化影響了植株的正常生長代謝，嚴(yán)重影響了這些保護(hù)酶的合成，進(jìn)而影響了正常的葉片生理功能。

PPO酶的活性并沒有隨黃化等級的增加而出現(xiàn)顯著的升高或降低，呈現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)。只在黃化最嚴(yán)重（Ⅴ級）有所增加，這就說明了黃化并不會直接影響PPO酶的含量，只有當(dāng)楊樹葉片出現(xiàn)極度營養(yǎng)不足或者枯死情況下，細(xì)胞萎縮，才會間接引起PPO酶的含量的增加以形成組織褐變，防止或者減少外界病原物的再次侵染。

俄羅斯楊葉黃化后，其各項(xiàng)生理生化指標(biāo)發(fā)生了不同程度的改變，輕微的黃化（Ⅱ級）對各指標(biāo)影響較小，但隨著黃化等級的升高各指標(biāo)含量均減少，尤其是葉綠素、SOD、POD含量。

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