【摘 要】隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥菌株的比例逐年上升，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益突出。為摸清禽源大腸桿菌病的流行情況及耐藥性，初步了解該病的流行情況，我們進(jìn)行了病原分離及藥敏實(shí)驗(yàn)，以為采取積極的綜合性防制措施提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】禽源大腸桿菌；細(xì)菌分離；藥敏試驗(yàn)；抗菌藥物

禽源大腸桿菌病是指部分或全部由致病性大腸桿菌感染引起的家禽局部或全身性感染的傳染病，臨床表現(xiàn)為多種病型：胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、卵黃性腹膜炎、全眼球炎、氣囊病、禽蜂窩組織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎等。家禽的大腸桿菌病一年四季均可發(fā)生，各種年齡和性別都易感。在規(guī)模養(yǎng)殖的條件下，該病是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，造成的損失不可低估。大腸桿菌血清型復(fù)雜多樣，為該病的防治帶來(lái)了一定的困難。

1材料與方法

1.1 材料

高壓滅菌器、顯微鏡、冰箱、電泳箱、微量糖發(fā)酵管、大腸桿菌O型抗血清（O1、O2、O78、O119）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，試驗(yàn)動(dòng)物：5日齡健康雛雞。藥敏試驗(yàn)紙片：氨芐青霉素（AMP）、阿莫西林（AMX）、頭孢吡肟（CPI）、頭孢曲松（CRO）、頭孢克洛（CEC）、鏈霉素（STR）、四環(huán)素（TET）、利福平（RIF）、紅霉素（ERY）、諾氟沙星（NOR）、復(fù)方新諾明（SXT）、頭孢噻肟（CTX）、新霉素（NEO）

1.2 樣品采集

從常州、南京及附近雞場(chǎng)采集臨診上具有典型大腸桿菌病病變的病死雞作為病料，采集十二指腸、肺以及肝臟作為分離細(xì)菌的材料。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

用無(wú)菌操作的方法將樣品分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂及營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。挑取疑似大腸桿菌的菌落連續(xù)純培養(yǎng)，獲得單個(gè)菌落細(xì)菌。

1.3.2 顯微鏡檢查

置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h后， 挑取表面光滑、邊緣整齊、微隆起的紅色單個(gè)菌落，經(jīng)革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特征。

1.3.3 生化鑒定

按常規(guī)方法對(duì)所有分離取得的分離菌培養(yǎng)物進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖的發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行吲哚、MR、V-P、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)。糖發(fā)酵試驗(yàn)在24h時(shí)觀察結(jié)果，其他生化試驗(yàn)在48～72h內(nèi)觀察結(jié)果。

1.3.4 血清型鑒定

用大腸桿菌單因子血清對(duì)大腸桿菌分離株進(jìn)行O血清型鑒定。將被檢菌株培養(yǎng)物水浴1h，破環(huán)其K抗原，在載玻片上經(jīng)凝集試驗(yàn)檢測(cè)分離菌株的血清型。

1.3.5 PCR檢測(cè)

針對(duì)fyu A保守序列設(shè)計(jì)引物P1：5’-GCGACGGGAAGC GATGACTTA-3’，引物P2：5’-CGCAGTAGGCACGATGTTGTA-3’（引物由上海生工生物工程公司合成）。PCR反應(yīng)體系：PCR Mix 12.5μL，P1、P2各1μL，模板（ RT反應(yīng)液） 2μL，加蒸餾水至總25μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（1%Goldview）20min，置于紫外燈下觀察并拍照。

1.3.6 動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)

將分離菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取健康雛雞10只，隨機(jī)分為A、B兩組，每組5只，A組腹腔接種營(yíng)養(yǎng)肉湯菌液，每只0.2ml；B組腹腔接種等量的滅菌生理鹽水作對(duì)照，隔離飼養(yǎng)觀察。

1.3.7 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片法對(duì)13種藥物進(jìn)行耐藥性檢測(cè)：用滅菌接種方法環(huán)取大腸桿菌純培養(yǎng)物，置于5ml滅菌生理鹽水中，用滅菌玻璃棒充分混勻，將此液滴于普通瓊脂培養(yǎng)基表面，用滅菌玻璃棒涂布使其覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基表面，置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)8～10min后取出。用滅菌尖頭鑷子取13種抗菌藥紙片分別對(duì)稱(chēng)貼到上述的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿貼4種紙片，為使抗菌藥紙片與培養(yǎng)基表面密貼，可用鑷子輕輕按一下紙片，在藥敏紙片上做上標(biāo)記或在平板底上用筆寫(xiě)上其藥名或貼上標(biāo)簽，將貼紙片的平板底部朝下，置于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24h。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)共分離到細(xì)菌40株，所有細(xì)菌在麥康凱平板上均生長(zhǎng)為表面光滑、邊緣整齊、圓形、隆起的紅色菌落；普通瓊脂平板上形成表面光滑、濕潤(rùn)、半透明、灰白色、圓形微凸起、中等大小的菌落。

2.2 顯微鏡檢查

被檢菌為兩端鈍圓、散布或成對(duì)、偶爾有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。大多數(shù)菌株以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，除少數(shù)菌株外，通常無(wú)可見(jiàn)莢膜。革蘭氏染色鏡檢均為形態(tài)均一、中等大小、散在排列的紅色桿菌，菌體兩端較深染，初步確定為大腸桿菌。

2.3 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）

注：+代表陽(yáng)性（產(chǎn)酸）， 代表陰性（不產(chǎn)酸）。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

經(jīng)平板凝集試驗(yàn)，確定了40株大腸桿菌的血清型：優(yōu)勢(shì)血清型為078，占62.5%；其他血清型以0119居多，這兩種血清型共占92.5%。（見(jiàn)表2）

2.5 PCR結(jié)果

以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果擴(kuò)增出與目的片段大小一致的DNA片段（見(jiàn)圖1）。

1：Marker DL2000；

2～12：隨機(jī)從40株大腸桿菌中抽取11株；

13：陽(yáng)性對(duì)照。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

雛雞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：接種1周后，A組雛雞全部死亡，剖檢死亡雛雞，大部分表現(xiàn)為敗血癥，少數(shù)表現(xiàn)為纖維素性心包炎、心包積液、肝表面被一層薄膜狀纖維素性滲出物覆蓋、氣囊炎。用死雞的心血、肝、脾接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h后，有菌落生長(zhǎng)，革蘭氏染色及生化化鑒定表明此菌與接種菌為同種細(xì)菌；B組雛雞則正常。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明：此次分離出的細(xì)菌對(duì)雛雞均有較強(qiáng)的致病性。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

40株致病性大腸桿菌的13種抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：所有細(xì)菌對(duì)RIF的耐藥率為100%。40株大腸桿菌全部對(duì)1種或多種抗生素有耐藥性，均敏感，其中只有1株對(duì)1種藥物耐受。（見(jiàn)表3）

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)被檢病料進(jìn)行病原分離與純化、病菌形態(tài)學(xué)檢查、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)以及血清學(xué)試驗(yàn)，鑒定為大腸桿菌。

用標(biāo)準(zhǔn)O抗原單因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的致病性大腸桿菌的血清型為O78。致病性大腸桿菌血清型多，有研究報(bào)道稱(chēng)在禽類(lèi)大腸桿菌病中，常見(jiàn)的病原性血清型包括O1、O35、O8 ，但在本次實(shí)驗(yàn)中除出現(xiàn)了1株（占4. 2% ）O1外，并未見(jiàn)其他血清型，與國(guó)內(nèi)已有的報(bào)道存在差異，這說(shuō)明我國(guó)禽類(lèi)大腸桿菌血清型分布存在著地區(qū)性和多樣性，這給本病的預(yù)防帶來(lái)很多困難。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：不論是同一地區(qū)的同一血清型或不同血清型，還是不同地區(qū)的同一血清型或不同血清型，它們對(duì)同一種藥物的敏感性可能相同，也可能不同，其原因可能與用藥歷史不同或細(xì)菌在傳代過(guò)程中質(zhì)粒丟失或增加使其耐藥性降低或提高有關(guān)。

大腸桿菌很容易產(chǎn)生耐藥性，由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)，它可以通過(guò)菌毛將耐藥質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌。近幾年來(lái)，由于各種抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株迅速增加。尤其是在一些養(yǎng)雞場(chǎng)內(nèi)，為了控制大腸桿菌和某些細(xì)菌感染，養(yǎng)殖者在飼料中添加或在治療中盲目使用抗菌藥物，致使大腸桿菌耐藥菌株越來(lái)越多、耐藥性也越來(lái)越嚴(yán)重。由于不同菌株對(duì)藥物的敏感性存在差異，建議在使用藥物治療病原菌時(shí)要加強(qiáng)對(duì)病原菌的耐藥性檢測(cè)，篩選出對(duì)病原菌敏感的藥物，按臨床指導(dǎo)合理用藥，以減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié)語(yǔ)

致病性大腸桿菌是重要的人畜共患病病原，盲目地使用抗生素類(lèi)藥物，會(huì)使抗生素所帶來(lái)的負(fù)面影響越來(lái)越重?？股貧埩魡?wèn)題的加劇，會(huì)直接影響禽類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量，威脅人類(lèi)健康。動(dòng)物的大腸桿菌病常常通過(guò)食物鏈的途徑對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害，因此，加強(qiáng)對(duì)病原菌耐藥性的檢測(cè)，定期總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，觀察耐藥趨勢(shì)，對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥和減緩細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生具有重要意義。為此，我們應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：

（1）以全價(jià)優(yōu)質(zhì)飼料喂養(yǎng)，經(jīng)常喂給多種維生素和電解質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力；

（2）定期清掃糞便，對(duì)地面、工具、水槽、料槽進(jìn)行清洗和消毒，保持飼料和飲水的清潔衛(wèi)生；

（3）嚴(yán)格掌握適應(yīng)性，避免濫用抗菌藥，確定有效的劑量和療程，嚴(yán)格遵守抗菌藥物局部使用、預(yù)防應(yīng)用、飼料添加及聯(lián)合使用的相關(guān)原則，有效地分期交替使用抗菌藥，根據(jù)細(xì)菌耐藥機(jī)制和抗菌藥結(jié)構(gòu)的關(guān)系尋找和研制出新的尤其對(duì)耐藥菌有抗菌活性的抗菌藥。