【摘 要】應用柯赫氏證病法則對地處甘肅省河西走廊西段酒泉、嘉峪關發(fā)生的地膜洋蔥根腐病病原進行了研究。對病部組織分離培養(yǎng)的結(jié)果是鐮刀菌（Fusarium）占64.58%，交鏈孢〔Alternaria〕占14.58%，其它各類雜菌等菌落占20.84%；回接苗期和成株期洋蔥植株，鐮刀菌可重現(xiàn)根腐病癥狀，其它菌落均則難以重現(xiàn)。因此確認，酒泉嘉峪關產(chǎn)區(qū)洋蔥根腐病的病原為鐮刀菌。

【關鍵詞】酒泉地區(qū)；嘉峪關地區(qū)；地膜洋蔥根腐?。荤牭毒?；病原菌研究

洋蔥根腐病（農(nóng)民俗稱脫底），是近年來甘肅省酒泉、嘉峪關洋蔥產(chǎn)區(qū)突發(fā)的重大病害，其主要癥狀是自進入5月初洋蔥葉片開始發(fā)黃，逐步表現(xiàn)外緣葉片枯萎、洋蔥鱗莖腐朽壞死；進入7月下旬～8月上旬病害發(fā)生程度加劇，表現(xiàn)連片發(fā)黃枯死，用手輕拔即起，根盤腐朽、須根脫落；濕度大的有蠅蛆腐生。洋蔥一旦被感染發(fā)病則完全喪失商品價值。

目前該病在酒泉嘉峪關的發(fā)病面積已涵蓋全部8000hm2洋蔥生產(chǎn)。其中普遍發(fā)病率在0.75%～4.9%之間，發(fā)病面積達5540 hm2，占酒嘉地區(qū)洋蔥面積比重達69.28%，造成實際經(jīng)濟損失達536.28萬元；重度病田發(fā)病率13.49%～24.08%；特重病田發(fā)病率可達78%，基本絕收。

和該病危害癥狀與發(fā)病規(guī)律相同的報道目前在國內(nèi)檢索文獻中尚屬未見；類似的報道有洋蔥干腐病，但除所描述鱗莖須根脫落癥狀和此病相似外，所述莖盤變色癥狀、附著粉紅色霉層的描述及所述病程、防治要點則和病區(qū)出現(xiàn)病害的基本特點完全不同。河西地區(qū)地處高原極旱荒漠灌溉農(nóng)業(yè)區(qū)，氣候類型和生產(chǎn)條件與國內(nèi)外其它洋蔥產(chǎn)區(qū)明顯不同；摸清本區(qū)域這一新發(fā)洋蔥根腐病的病原，對下一步研究確定該病害和國內(nèi)其它區(qū)域所述病害是否相同或?qū)儆谙嗤『Φ牡乩碜兎N，以及對開展洋蔥品種在洋蔥產(chǎn)區(qū)間的引種和抗病品種選育、制定相應的大田防治規(guī)程都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

于2011年秋季在區(qū)域內(nèi)各生態(tài)點廣泛采集典型發(fā)病標本40份，置于低溫庫備用。

按經(jīng)典配方配制好PDA培養(yǎng)基，與清洗干凈的培養(yǎng)皿一起置高壓滅菌鍋（6.8kg、121℃）濕熱消毒30min；將標本用清水淘洗干凈，切下病間組織，在無菌工作間將切制好的病樣標本按常規(guī)措施消毒處理后置PDA平面培養(yǎng)基，后轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱（30℃）培養(yǎng)4～7d，5d后統(tǒng)計出現(xiàn)的各類真菌、細菌菌落數(shù)。

1.2 致病性測定

1.2.1 病原菌實驗室致病性測定

于2012年3月19日在無菌操作間將中度感病品種黃皮02洋蔥鱗莖削去基部莖盤，在削去部位打三角錐形小坑，用75%酒精表面消毒并用無菌水清洗干凈；將分離獲得經(jīng)過純化的不同病菌菌塊反接到洋蔥鱗莖莖盤三角坑內(nèi)，以無菌落生長的PDA培養(yǎng)基接種做對照，用封口塑袋封口（留有氣孔）置恒溫箱培養(yǎng)7d，統(tǒng)計發(fā)病率。

1.2.2 田間柯赫氏證病法則鑒定

（1）病原純化繁殖：將經(jīng)過實驗室測定對洋蔥有明顯毒性的病原鐮刀菌，和其它分離到的病菌分別用PDA純化后，定量轉(zhuǎn)接到250ml錐形瓶小麥粒培養(yǎng)料中，置28℃恒溫箱培養(yǎng)7d，期間翻轉(zhuǎn)搖晃接種使菌絲在培養(yǎng)料中生長均勻，后置冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）試驗地消毒與規(guī)劃設計、田間接種。選擇向陽溫室兩間，面積66.7㎡，于2012年4月16日用棚膜密閉覆蓋地表，經(jīng)過50d太陽強光照射高溫加熱土壤消毒處理， 6月4日揭去棚膜泡好地， 6月12日按小區(qū)面積0.2㎡、5次重復設計劃好小區(qū)，小區(qū)間埋設地膜進行隔離，將繁殖好的病原摻入各小區(qū)土壤，每個小區(qū)接種病原50g，對照小區(qū)接種煮熟麥粒。

（3）播種與試驗管理。選擇中感根腐病的洋蔥品種黃皮02飽滿種子，經(jīng)75%酒精常規(guī)消毒后用無菌水淘洗并保濕催芽，6月15日播入試驗小區(qū)，覆蓋經(jīng)過碾壓的軟草噴灑自來水保濕，苗出全后撤去軟草按正常洋蔥生產(chǎn)進行管理，跟蹤觀察并記錄發(fā)病數(shù)據(jù)。

1.3 致病菌分類鑒定

實驗室和田間接種發(fā)病植株采集標本再分離，鏡檢確定發(fā)病洋蔥分離獲得病原和接種病原一致后進行病原菌分類地位鑒定。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

采自酒泉、金塔、嘉峪關、玉門鎮(zhèn)病樣標本40份，分離2批次共獲得480個菌落，其中目標菌落鐮刀菌310個、占總數(shù)64.58%，為主體菌落；交鏈孢菌落70個、占總數(shù)14.58%，為次主體菌落；雜菌細菌菌落30個、占總數(shù)6.25%，雜菌真菌菌落70個、占總數(shù)14.58%。統(tǒng)計結(jié)果見表2。

2.2 致病性測定結(jié)果

2.2.1 病原菌實驗室致病性測定

試驗結(jié)果鐮刀菌〔Fusarium〕對成品洋蔥有明顯的致病力。在無菌環(huán)境下30℃恒溫培養(yǎng)結(jié)果，從接種至癥狀出現(xiàn)潛伏期6d，發(fā)病部位出現(xiàn)典型莖盤腐爛癥狀、著生白色菌絲，經(jīng)再分離獲得與原始病原培養(yǎng)性狀和顯微觀察性狀相一致的病菌。

接種交鏈孢〔Alternaria〕、細菌〔Bacteria〕、雜真菌〔Penicilium、Pyzhium〕對成品洋蔥均無明顯致病力。接種6d后，交鏈孢接種部位呈深褐色，細菌接種部位透亮化膿，雜真菌接種部位發(fā)褐；三者接種傷口均無明顯擴展，對傷口部位病原做再分離與顯微鏡鏡檢結(jié)果，均有原接種病菌特征。鑒定結(jié)果詳見表3。

2.2.2 病原菌田間柯赫氏法則鑒定

田間接種鑒定試驗之鐮刀菌接種小區(qū)于6月21日發(fā)病， 7月26日調(diào)查統(tǒng)計：鐮刀菌反接發(fā)病最充分，發(fā)病率達到63.95%，空白對照發(fā)病率為0.00%；細菌、交鏈孢、青霉菌、腐霉菌反接發(fā)病率均為0.00%。8月24日調(diào)查統(tǒng)計鐮刀菌發(fā)病率達到79.88%，空白對照發(fā)病率為10.66%，細菌反接發(fā)病率7.54%，交鏈孢、青霉菌、腐霉菌反接發(fā)病率分別是：11.98%、12.81%、11.32%。

試驗結(jié)果顯示：鐮刀菌接種對洋蔥侵染毒性大，是引起洋蔥根腐病的直接因素；交鏈孢、青霉菌、腐霉菌前期調(diào)查均未引起典型根腐病癥狀，后期調(diào)查發(fā)病率與對照相似，經(jīng)過對發(fā)病標本再分離獲得病原均為鐮刀菌，不是所接種病原，說明引起感病是因為試驗區(qū)內(nèi)部病原隨澆水擴散侵染所引起的發(fā)病。同時顯示細菌對根腐病發(fā)病有遏制作用。詳見表4。

2.3 病原菌生物性狀觀察

2.3.1 致病菌培養(yǎng)性狀觀察

致病病原鐮刀菌實驗室培養(yǎng)性狀觀測：在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落為圓形、氣生菌絲棉絮狀、純白色，邊緣較整齊，不容易產(chǎn)生典型分生孢子；轉(zhuǎn)接到瓊膠+葡萄糖+玉米淀粉培養(yǎng)基上菌落氣生菌絲長勢明顯衰弱，菌絲在培養(yǎng)基表面匍匐擴散；培養(yǎng)4d后菌落直徑大于2.5cm，產(chǎn)生明顯的白色粉狀分生孢子。

PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)性狀 瓊膠+葡萄糖+玉米淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)性狀

瓊膠+葡萄糖+玉米淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)分生孢子性狀

2.3.2 致病菌顯微性狀觀察

對田間自然產(chǎn)生的病菌團、室內(nèi)培養(yǎng)病原菌鏡檢結(jié)果：致病菌菌絲無色或白色，菌絲分隔明顯，菌絲團中均未發(fā)現(xiàn)明顯的有性世代繁殖體（配子、配子囊）。

顯微鏡鏡檢可見典型的鐮刀狀、非鏈狀著生的分生小孢子；小型分生孢子自單出瓶狀小分生孢子梗產(chǎn)生，橢圓至卵圓形，大型分生孢子鐮刀型；厚垣孢子在菌絲短側(cè)枝上間生和頂生。

分生孢子大?。河?個隔膜與5個隔膜兩種，以3個隔膜為主。顯微測定結(jié)果3個隔膜的為33～36×3.8～4um，5個隔膜的為44×3.94um。

尖孢鐮刀菌菌絲、孢子顯微照片

2.3.3 致病菌分類地位檢索鑒定結(jié)果

2012年10月經(jīng)甘肅省農(nóng)科院植保所對致病病原菌進一步鑒定，確認該病源為：尖孢鐮刀菌，該菌屬于半知菌類，叢梗孢目，瘤座孢科，鮮色多孢族，鐮刀菌屬（鏈孢霉屬）尖孢鐮刀菌（尖鐮孢霉）。

3 結(jié)果討論

根據(jù)以上兩年試驗的結(jié)果，酒嘉地區(qū)地膜洋蔥根腐病病原為尖孢鐮刀菌。

試驗過程、取樣范圍和工作方法以植病研究方法的要求為依據(jù)，參考了相關的研究資料，取樣范圍覆蓋了酒嘉地區(qū)不同生產(chǎn)區(qū)域，試驗結(jié)果應當可以代表酒泉市、嘉峪關市洋蔥產(chǎn)區(qū)地膜洋蔥根腐病基本狀況，也有待后人繼續(xù)檢驗驗證。

基金項目：酒泉市農(nóng)科院科技創(chuàng)新專項（JQK2009-003）

參考資料：

[1]商鴻生，王鳳葵.蔥蒜類蔬菜病蟲害診斷與防治原色圖譜M.北京：金盾出版社，2002：22.

[2]南京農(nóng)學院.普通植物病理學 上冊M.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：18-73.

[3]魏景超.真菌鑒定手冊M.上海：上?？茖W技術出版社，1979：406-622.

[4]〔英〕C.布斯著.鐮刀菌屬M.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988：32-177.