【中圖分類(lèi)號(hào)】R711 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-3783（2013）12-0250-01

【摘要】目的 觀察P27mt基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞的放射增敏作用。方法 MTT法檢測(cè)P27mt基因和放射線對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用，繪制抑制率曲線圖研究P27mt基因與放射聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的作用特點(diǎn)；流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果 單純照射對(duì)宮頸癌增殖有抑制作用，但有平臺(tái)效應(yīng)；P27mt基因?qū)ela細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈時(shí)間和濃度依賴性；照射聯(lián)用P27mt基因可進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)宮頸癌的殺傷效應(yīng)；單獨(dú)照射和P27mt基因均能使細(xì)胞周期阻滯于放射敏感時(shí)相G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，聯(lián)用效果更加顯著。結(jié)論P(yáng)27mt基因可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞產(chǎn)生放療增敏作用。

宮頸癌是我國(guó)也是本地區(qū)最常見(jiàn)惡性腫瘤，放射治療是重要治療手段，目前多采用同步放化療綜合治療模式，即通過(guò)同步應(yīng)用小劑量化療藥物在不增加甚至降低射線劑量的基礎(chǔ)上達(dá)到增強(qiáng)放射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[1] 。

p27 基因是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子（CDKI） 家族成員之一，是一類(lèi)重要的細(xì)胞周期調(diào)控基因，可廣泛抑制細(xì)胞周期素（ cyclin） 和細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK） 復(fù)合物的活性對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)性調(diào)控[2] 。Jean 等[3] 將p27 第187 位蘇氨酸置換成丙氨酸（T187A） 轉(zhuǎn)染HeyC2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，證實(shí)突變p27 （p27mt） 比野生型p27 抑制作用更強(qiáng)。p27mt對(duì)宮頸癌放療作用如何未見(jiàn)有人報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌Hela細(xì)胞株和p27mt 由湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床研究所惠贈(zèng)； Clinac 600C/D加速器（ 美國(guó)Varian 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coluter公司）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2照射方法 在室溫下采用6MV-X線照射，照射野10×10cm，劑量率40 cGy/min，源皮距為100cm，分別一次性給予各實(shí)驗(yàn)組6、8、10、12、14、16Gy劑量。

1.2.3放射線對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)按輻射劑量分為6、8、10、12、14、16Gy共6組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，給予一次性射線照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），繼續(xù)孵育4h，棄各孔液體，每孔加入150μL二甲基砜，低速震蕩10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在562nm波長(zhǎng)處吸光度值，計(jì)算抑制率，求出輻射劑量坪值，即細(xì)胞增殖抑制率達(dá)最高的射線劑量。細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值） ×100%。

1.2.4MTT法測(cè)定p27mt的輻射敏感性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分為空白組、單藥組、單放組、藥放組。空白組只加細(xì)胞與培養(yǎng)液；單放組劑量取上述實(shí)驗(yàn)的坪值；單藥組p27mt基因終濃度參照文獻(xiàn)[4] 確定為10、20，30，40，50MOL（感染復(fù)數(shù)）共5組，藥放組輻射劑量和藥物濃度分別同單放組劑量和單藥組濃度，共5組，每組設(shè)5個(gè)平行樣本，測(cè)定各組吸光值后通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.5細(xì)胞周期分析及凋亡檢測(cè) 細(xì)胞分組及處理同1.2.4，取處理完畢的4組細(xì)胞各1×106個(gè)， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定過(guò)夜，清除固定液，加入PBS100μl混勻細(xì)胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混勻，置37℃水浴鍋中加溫30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常溫避光30min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycle軟件分析，擬合計(jì)算出細(xì)胞各時(shí)相百分比和凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，SPSS17.0軟件模擬生存曲線并進(jìn)行單因素方差分析（兩兩比較采用S-N-K法），以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞對(duì)射線照射的敏感性 射線照射對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖可產(chǎn)生明顯的抑制作用，在射線劑量12Gy以內(nèi)時(shí)，隨著射線劑量的加大和照射后作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率也明顯增加，呈現(xiàn)出一定的量效和時(shí)效關(guān)系。在12Gy處出現(xiàn)坪值，故選用12Gy加藥物進(jìn)行后續(xù)的增敏實(shí)驗(yàn)。

2.2p27mt基因?qū)ela細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)不同濃度p27mt作用24、48、72h后，Hela細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈時(shí)間，濃度依賴性。各濃度姜黃素作用48h，細(xì)胞增殖抑制率在6%-78%之間，與對(duì)照組比較，20MOLp27mt基因即可產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的抑制作用（P<0.05），而20MOL及以上濃度的p27mt抑制作用則更強(qiáng)（P<0.01）。

2.3p27mt基因?qū)ela細(xì)胞的放射增敏作用 選取12Gy劑量射線加不同濃度p27mt基因作用于Hela細(xì)胞結(jié)果顯示出細(xì)胞增殖抑制率可進(jìn)一步隨藥物濃度的增加而升高，當(dāng)濃度大于40MOL時(shí)曲線趨于平坦。藥物加輻射后，其24h細(xì)胞增殖抑制率均較單純輻射或單純藥物組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.4細(xì)胞周期分析及凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡結(jié)果表明，與空白組比較，單純放射或藥物均能提高G2/M期細(xì)胞比例，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡（P<0.05），而放射與藥物聯(lián)合則作用效果更為顯著（P<0.01）。

3討論

重組腺病毒作為一種高效基因轉(zhuǎn)移載體被廣泛用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞，原因是腺病毒本身分子穩(wěn)定，基因組不會(huì)發(fā)生重排，插入的外源基因也相當(dāng)穩(wěn)定，腺病毒允許插入的外源基因容量可達(dá)7.5Kb，不僅感染分裂期細(xì)胞，也可感染靜止期細(xì)胞，感染率幾乎100 % 。另外，它不與宿主基因組整合，沒(méi)有基因毒性，比較安全。因此本研究擬通過(guò)腺病毒將突變型p27基因和X射線聯(lián)合作用宮頸癌Hela細(xì)胞株模型，通過(guò)檢測(cè)其放射敏感性及細(xì)胞周期及凋亡的改變，探討p27基因放射增敏的作用及機(jī)制，為在臨床上將突變型p27做為宮頸癌放療增敏劑提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，單純應(yīng)用p27mt，細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度的增加成正比；單純應(yīng)用放射線照射，細(xì)胞抑制率也隨射線劑量的增加而增加，但當(dāng)輻射劑量達(dá)到12Gy時(shí)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到坪臺(tái)期，不再隨射線劑量的加大而增加。在此基礎(chǔ)上，選用12Gy放射線聯(lián)合不同濃度的p27mt做進(jìn)一步的觀察，結(jié)果顯示，在單純輻射劑量已達(dá)到“閾值”的情況下，聯(lián)用p27mt仍可使細(xì)胞增殖抑制效果得到進(jìn)一步的提高，且對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率高于單純放射組和單純藥物組（P<0.05），說(shuō)明同步應(yīng)用p27mt確實(shí)可對(duì)宮頸癌細(xì)胞放療產(chǎn)生增效的作用，但這種增效作用只是控制在一定濃度的范圍之內(nèi)。

為初步探明增效機(jī)制，筆者進(jìn)一步檢測(cè)了p27mt同步放療后對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)p27mt、單獨(dú)射線均能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡和G2/M期阻滯的作用，而聯(lián)合應(yīng)用后作用效果更為顯著，這說(shuō)明p27基因可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于對(duì)G2/M期達(dá)到放療增敏的作用。

參考文獻(xiàn)

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