【中圖分類號】R596 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0225-02

【摘要】目的：通過對苯丙酮尿癥患者的產(chǎn)前情況進(jìn)行診斷分析，為預(yù)防此病提供科學(xué)依據(jù)，從而提高優(yōu)生優(yōu)育率。方法：采用人類苯丙氨酸羥化酶cDNA限制酶片段長度進(jìn)行多態(tài)性連鎖分析，收治2例苯丙酮尿癥高危胎兒做產(chǎn)前診斷，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：產(chǎn)前診斷與胎兒出生后情況或人工流產(chǎn)手術(shù)后的結(jié)果相符。結(jié)論：苯丙酮尿癥患者的產(chǎn)前情況在測定PAH活力時(shí)還存在著一定的難度，因此苯丙酮尿癥患者的產(chǎn)前診斷只能通過分析胎兒的PAH基因來完成。

【關(guān)鍵詞】苯丙氨酸羥化酶；脫氧核糖核酸；血清苯丙氨酸；苯丙酮尿癥；產(chǎn)前診斷；PKU；PAH；基因

1、臨床資料

苯丙酮尿癥（PKU）是一種比較常見的遺傳性氨基酸代謝病，在我國人群中發(fā)病率十分低?；颊哂捎诟闻K內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶（PAH）缺乏，苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酪氨酸而在體內(nèi)累積?；純撼錾笕舨患皶r(shí)得到低苯丙氨酸飲食治療，便出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的大腦損害和智力發(fā)育遲緩。因此認(rèn)真開展PKU的產(chǎn)前診斷，防止PKU患兒的出生和淘汰PKU致病基因，對于保障人民健康，提高人口素質(zhì)具有特別重要的意義。

1.1 一般資料。從上海收集2例PKU患者進(jìn)行產(chǎn)前診斷，其中一例高危妊娠者年齡為30歲，另一例為28歲，均為第二胎，其妊娠周數(shù)分別為9周和17周。

1.2 PKU患兒臨床表現(xiàn)。PKU患兒臨床上均有智力落后、頭發(fā)變黃、皮膚白嫩、尿鼠臭味及FeCl3試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性。

1.3血清苯丙氨酸診斷情況。2例患者中一例血清苯丙氨酸濃度為0.90mmol/L，另一例為0.83mmol/L。

1.4 PAH與cDNA探針的準(zhǔn)備。重組質(zhì)粒phPAH247用EcoRI消化后，經(jīng)瓊脂糖制備電泳分離得到2.4Kb的PAH全長cDNA，經(jīng)缺口翻譯制備標(biāo)記的PAH與cDNA探針。

2、方法

2.1 血清苯丙氨酸濃度測定。將PKU患兒及其雙親的血清進(jìn)行分離，用LKB4400型氨基酸自動分析儀測定血清苯丙氨酸和酪氨酸濃度。

2.2 患兒和胎兒DNA的提取。（1）患兒DNA提?。翰杉純杭捌潆p親的抗凝靜脈血，分離白細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)方法提取高分子DNA；（2）胎兒DNA的提?。河谌焉?～10周時(shí)，在B型超聲波定位下，采集絨毛20mg左右?；蛴谌焉?7周時(shí)，用改良的羊膜腔穿刺術(shù)采集羊水20ml，按前邊方法提取胎兒DNA。

2.3 PAH基因的限制酶位點(diǎn)多態(tài)性分析?；純杭捌涓改傅腄NA分別用限制性內(nèi)切酶BglII、EcoRI、EcoRV、Mspl和PvuII消化，經(jīng)瓊脂糖電泳，Southern印跡法轉(zhuǎn)移后，與前邊標(biāo)記出的人類PAH與cDNA探針雜交和放射性自顯影，得到基因圖譜，對于PAH基因的6個(gè)酶切位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，并根據(jù)這些多態(tài)性位點(diǎn)在患兒及其雙親的遺傳關(guān)系中，找出與缺陷PAH基因連鎖的多態(tài)性DNA片段，作為遺傳標(biāo)志進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

2.4 胎兒的產(chǎn)前基因診斷。根據(jù)在限制酶位點(diǎn)多態(tài)性分析中找到的遺傳標(biāo)志，選用合適的內(nèi)切酶消化PKU高危胎兒的絨毛或羊水DNA，制作PAH基因圖譜，鑒定出胎兒是否遺傳得其雙親的缺陷PAH基因。并根據(jù)這10例孕婦于人流或分娩后所采集的胎兒臍帶血，抽取白細(xì)胞DNA，制作限制酶酶譜，來檢驗(yàn)產(chǎn)前診斷的結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0建立數(shù)據(jù)庫，對10例苯丙酮尿癥高危胎兒患者進(jìn)行t檢驗(yàn)和x2查驗(yàn)并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3、結(jié)果

3.1 血清苯丙氨酸測定。2例PKU家系的患兒血清苯丙氨酸濃度的測定結(jié)果表明，其父母結(jié)果雖然在正常值范圍內(nèi)，但患兒的血清苯丙氨酸濃度均>0.73 mmol/L。因此患兒屬于苯丙酮尿癥。

3.2 限制酶位點(diǎn)多態(tài)性分析。通過對患兒進(jìn)行PAH基因的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)多態(tài)性分析，其結(jié)果表明應(yīng)用內(nèi)切酶分析可以完全診斷出患兒是否患苯丙酮尿癥，同時(shí)根據(jù)內(nèi)切酶分析數(shù)據(jù)也可以排除胎兒患苯丙酮尿癥。

3.3 PKU產(chǎn)前基因診斷。2例PUK高危胎兒產(chǎn)前診斷選用的內(nèi)切酶及產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示，胎兒臍血DNA的酶譜分析結(jié)果和絨毛或羊水DNA分析結(jié)果相同，對產(chǎn)前診斷為非PUK的胎兒，于出生6個(gè)月后經(jīng)隨訪證實(shí)產(chǎn)前診斷結(jié)果正確。

4、結(jié)論

人類的PAH僅存在于肝臟，PAH催化的將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸的代謝反應(yīng)只局限在肝臟內(nèi)進(jìn)行。胎兒血、絨毛和羊水細(xì)胞內(nèi)均沒有PAH的合成，無法測定其PAH活力，因此PKU的產(chǎn)前診斷只能通過分析胎兒的PAH基因來完成。我們應(yīng)用限制酶位點(diǎn)多態(tài)性連鎖分析技術(shù)對2例PUK高危胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷，這種多態(tài)性連鎖分析技術(shù)是目前遺傳病產(chǎn)前診斷最常用的技術(shù)，其關(guān)鍵是要在家系成員中，找到可作遺傳標(biāo)志而能提供產(chǎn)前診斷信息的多態(tài)性位點(diǎn)。

據(jù)專家研究表明，人類DNA每100個(gè)核苷酸便有一個(gè)發(fā)生中性替代，這種替代不會造成基因表達(dá)的缺陷，但能改變限制酶的切點(diǎn)，因而產(chǎn)生相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的多態(tài)性。對此，我們曾經(jīng)分析研究了28個(gè)中國PKU家系多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)對中國人PKU基因診斷最有價(jià)值的是限制酶EcoRV和PvuII。這兩種酶不僅價(jià)格便宜，而且雜合的多態(tài)性比率高，因而提供基因診斷的信息多。若組合應(yīng)用8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，可對大多數(shù)（約占80%）的苯丙酮尿癥家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷或攜帶者檢測。但還有20%的PKU家系因沒有雜合的多態(tài)性位點(diǎn)，因而不能用這種多態(tài)性連鎖分析技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

據(jù)估計(jì)，人類DNA中每100個(gè)核苷酸便有一個(gè)發(fā)生中性替代，這種替代不會造成基因表達(dá)的缺陷，但能改變限制酶的切點(diǎn)，因而產(chǎn)生相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)多態(tài)性。我們通過擴(kuò)大PAH基因的限制酶酶譜分析，來發(fā)現(xiàn)更多的多態(tài)性位點(diǎn)，并將其應(yīng)用于PKU的產(chǎn)前診斷，從而提高產(chǎn)前診斷的可能性。在進(jìn)行產(chǎn)前診斷的10例PKU高危胎兒中，有5例只能作排除診斷，因?yàn)殡p親中只有一方存在雜合的限制酶位點(diǎn)多態(tài)性。因此，隨著PAH突變基因DNA堿基替代技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用核苷酸雜交進(jìn)行PKU產(chǎn)前基因診斷和對攜帶者進(jìn)行檢驗(yàn)，具有十分廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)

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