【中圖分類號(hào)】R378.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-3783（2013）12-0186-01

【摘要】耐藥結(jié)核病是全世界結(jié)核病疫情第三次回升的重要原因，結(jié)核病耐多藥菌株的出現(xiàn)增加了結(jié)核病治療的難度，目前，用于結(jié)核病治療的一線要主要是利福平和異煙肼。異煙肼耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，與之耐藥相關(guān)的基因較多，如：katG，inhA，aphC，kasA，ndh等。其中最主要的耐藥基因?yàn)閗atG 、inhA 基因。利福平相關(guān)耐藥基因研究較為明確，目前認(rèn)為rpoB基因的突變是MDR-MTB菌株的標(biāo)志。迄今為止，對(duì)利福平和異煙肼抗結(jié)核分支桿菌耐藥性的檢測(cè)方法有多種，實(shí)際工作中需要將多種檢測(cè)方法同時(shí)運(yùn)用，以使檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信，及時(shí)為臨床治療提供有效的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】耐藥結(jié)核?。焕Ｆ?，異煙肼；耐藥基因；檢測(cè)方法

肺結(jié)核是世界上主要的公共衛(wèi)生問題，是嚴(yán)重危害人類身體健康的傳染性疾病之一。二十世紀(jì)五、六十年代人們便期望找到一種有效的方法來(lái)控制肺結(jié)核的傳染，最后達(dá)到治愈結(jié)核病的目的，但目前肺結(jié)核仍是一個(gè)全球性的流行病，成為全球性的公共衛(wèi)生問題，每年大概有2-3百萬(wàn)的人死于這種疾病。近年來(lái)，肺結(jié)核在艾滋病患者中的廣泛傳播再一次引起了公眾的關(guān)注1，耐藥結(jié)核桿菌尤其是耐多藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)和傳播是導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病率升高的重要原因。本文就結(jié)核桿菌對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)基因，以及耐藥性檢測(cè)的方法做一綜述2。

1 異煙肼

異煙肼（isoniazid，INH），是抗結(jié)核病的常用一線藥物，在結(jié)核病的治療中一直起著重要的作用。但大多數(shù)結(jié)核病患者如果長(zhǎng)期用藥易產(chǎn)生耐藥性，這主要是由于長(zhǎng)期使用INH可誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生基因突變，從而使細(xì)菌對(duì)INH的耐藥性增強(qiáng)。有研究表明 。

1.1 katG 基因是過氧化氫酶‐過氧化物酶的編碼基因，katG基因全長(zhǎng)2223個(gè)核苷酸，上游與相隔44個(gè)堿基的furA基因（一種結(jié)核桿菌鐵調(diào)控蛋白編碼基因，可能為katG基因的啟動(dòng)子，并調(diào)控其表達(dá)）相連，下游與相隔2794個(gè)堿基的embC基因相連。katG 基因最常見的點(diǎn)突變位點(diǎn)是第315位氨基酸和第463 位氨基酸。其常見的點(diǎn)突變是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突變通常會(huì)造成過氧化氫一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐藥。在C. Yao1， T. Zhu2， Y. Li1， L. Zhang1， B. Zhang1， J. Huang1 and W. Fu 的研究中選取了41個(gè)樣本，其中32個(gè)分離株的突變是AGC→ACC，9個(gè)分離株的突變是AGC→AAC。此外還有研究發(fā)現(xiàn)katG基因104、108、138、148位等突變。因而katG基因序列改變的具體位點(diǎn)與katG酶的活性的改變還有待進(jìn)一步的研究。

1.2 inhA 基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依賴的enoyl‐ACP 還原酶的編碼基因。當(dāng)活化的INH（異煙堿酰基）與inhA酶（enoyl-ACP還原酶）活性部位的輔因子NAD結(jié)合后，生成高親和力的共價(jià)化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP還原酶的親和力，進(jìn)而干擾了脂酸的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。inhA 基因突變約占異煙肼臨床耐藥株的8% ～ 20% ，耐藥的發(fā)生可由于inhA結(jié)構(gòu)基因突變?cè)斐蒊NH與NADH的親和力下降，或是inhA啟動(dòng)子-15的C→T的點(diǎn)突變，引起對(duì)INH耐藥。與katG基因突變相比較，inhA基因的突變伴隨低水平INH耐藥性，InhA的突變不僅引起INH耐藥，還會(huì)引起結(jié)構(gòu)相近的二線抗結(jié)核藥物乙硫異煙（ETH）的耐藥性，而katG突變后耐藥水平的高低取決于基因突變對(duì)過氧化氫—過氧化物酶活性的影響，突變導(dǎo)致酶活性完全喪失可引起高度INH耐藥。

1.3 kasA 基因，ahpC基因和ndh基因

kasA 基因編碼β‐酮?；d體蛋白合成酶，與分枝菌酸生物合成相關(guān)，是異煙肼耐藥的另一個(gè)相關(guān)基因，最常見的突變是第312位點(diǎn)。ahpC 基因是烯?；€原酶的編碼基因，參與氧化-應(yīng)激應(yīng)答的表達(dá)，它能控制解毒酶基因的如katG 基因的表達(dá)。Dhandayuthapani[9]等發(fā)現(xiàn)部分katG突變的耐異煙肼分離株存在ahpC啟動(dòng)子（存在于oxyR-ahpC區(qū)）突變，增強(qiáng)ahpC表達(dá)來(lái)補(bǔ)償過氧化氫酶一過氧化物酶的缺乏，從而抵抗宿主巨噬細(xì)胞的氧化。ndh 基因能編碼NADH 脫氫酶，ndh 基因的突變使NADH 脫氫酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制異煙肼的過氧化，也阻止異煙酰乙酸NADH 與inhA 酶的結(jié)合，從而使結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥性。katG、inhA、kasA 、ahpC和ndh基因突變并不能解釋所有的異煙肼耐藥問題，相關(guān)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

隨著異煙肼耐藥相關(guān)基因和耐藥機(jī)制的深入研究，其敏感性必定會(huì)得到較大提高。

2 利福平

利福平是抗結(jié)核病多藥聯(lián)合方案中的主要成分之一，其主要作用對(duì)象是結(jié)核分枝桿菌DNA 依賴的RNA 聚合酶的β 亞基，通過抑制mRNA 的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗菌作用，與之相關(guān)的耐藥基因主要是其編碼基因rpoB。rpoB基因是結(jié)核桿菌DNA依賴RNA聚合酶β亞單位的編碼基因，全長(zhǎng)3543個(gè)堿基，95%左右的RFP耐藥菌株的基因突變都集中在rpoB基因507～533位的27個(gè)氨基酸（81bp）組成的區(qū)域，這一突變區(qū)被稱為利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）。當(dāng)RRDR發(fā)生突變時(shí)，包括點(diǎn)突變或短的插入、缺失突變等，使DNA依賴性RNA聚合酶B亞單位酶結(jié)構(gòu)改變，利福平不能與細(xì)菌RNA聚合酶β亞單位結(jié)合而表現(xiàn)為耐藥。已知RFP耐藥菌的rpoB基因有14種突變，其中9種突變對(duì)利福布丁和利福噴丁交叉耐藥。531、526位點(diǎn)突變株對(duì)所有利福霉素類藥物均高度耐藥。到目前為止，利福平相關(guān)耐藥基因研究已較明確，其中以編碼531位氨基酸的堿基TCG→TTG的和編碼526位氨基酸的堿基CAC→TAC的突變最常見，因此這個(gè)區(qū)域的突變可作為一種檢測(cè)結(jié)核桿菌耐RFP簡(jiǎn)易、快速的方法。在臨床分離的MDR-MTB中，86%的耐藥株有rpoB基因的突變，因此認(rèn)為rpoB基因的突變是MDR-MTB菌株的標(biāo)志。

3耐藥性的檢測(cè)方法

迄今為止，對(duì)利福平和異煙肼抗結(jié)核分支桿菌耐藥性的檢測(cè)方法有多種。變色液體培養(yǎng)基法3利用選擇性培養(yǎng)基顏色的改變以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。MTT檢測(cè)法4 5也被用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)，MTT是黃色四唑鹽燃料能在有代謝活性的細(xì)胞內(nèi)被脫氫酶降解產(chǎn)生紫色的甲月替，進(jìn)而通過分光光度計(jì)（570nm）檢測(cè)吸收光的變化。SYBR Green I-based real-time定量PCR檢測(cè)法6也被用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，The GenoType MTBDRplus assay7是目前在結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的一種方法，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比較，該方法更能快速的檢測(cè)出耐藥的突變基因，但Jin8 等的研究表明，雖然The GenoType MTBDRplus assay具有較強(qiáng)的優(yōu)越性，但在其研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)較罕見的katG S315N突變卻不在這一檢測(cè)方法內(nèi)。

隨著結(jié)核分支桿菌耐藥性的不斷增強(qiáng)以及新型耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，目前如果只單純的運(yùn)用某一方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)是不能得到準(zhǔn)確可信的結(jié)果，因而我們要將多種檢測(cè)方法同時(shí)運(yùn)用，以使檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信為結(jié)核分枝桿菌耐藥的檢測(cè)提供優(yōu)效的證據(jù)。

4 展望

結(jié)核病耐多藥菌株的出現(xiàn)增加了結(jié)核病治療的難度，而耐藥機(jī)制是治療的關(guān)鍵，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，耐藥機(jī)制的研究得到了有效的提高。結(jié)核病耐多藥菌株主要是由于基因的突變引起，及時(shí)對(duì)患者的突變菌株進(jìn)行檢測(cè)為臨床的治療將提供有效的治療依據(jù)，從而減輕患者的病情，為進(jìn)一步治療和控制耐多藥結(jié)核病提供了有效的手段。

參考文獻(xiàn)

[1].

[2]Visalakshi， P.， Meharwal， S. K.， Myneedu， V. P. Behera， D. Evaluation of direct method of drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid by nitrate reductase assay in a national reference laboratory. Diagnostic microbiology and infectious disease 66， 148-152， doi：10.1016/j.diagmicrobio.2009.09.008 （2010）.

[3]Toit， K. et al. The Colour Test for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains. The international journal of tuberculosis and lung disease ： the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease 16， 1113-1118， doi：10.5588/ijtld.11.0609 （2012）.

[4].

[5].

[6]Hsueh， C.-W. et al. Quantitative diagnosis and analysis of mutations affecting drug resistance to rifampicin and isoniazid of clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Taiwan. Annals of Microbiology 60， 391-397， doi：10.1007/s13213-010-0054-z （2010）.

[7]Chryssanthou， E. Angeby， K. The GenoType（R） MTBDRplus assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Sweden. APMIS ： acta pathologica， microbiologica， et immunologica Scandinavica 120， 405-409， doi：10.1111/j.1600-0463.2011.02845.x （2012）.

[8]Jin， J. et al. Evaluation of the GenoType（R） MTBDRplus assay and identification of a rare mutation for improving MDR-TB detection. The international journal of tuberculosis and lung disease ： the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease 16， 521-526， doi：10.5588/ijtld.11.0269 （2012）.