【中圖分類號】R97 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0184-01

【摘要】本文探討了姜黃素（Cur）對人宮頸癌Hela細(xì)胞放射增敏的可能作用機(jī)制。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞處理后P21和Bcl-2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示姜黃素和射線單用均能升高P21蛋白表達(dá)和降低Bcl-2蛋白的表達(dá)（P﹤0.05），二者聯(lián)用則變化更明顯（P﹤0.01）。說明姜黃素對人宮頸癌Hela細(xì)胞具有放射增敏作用可能與其上調(diào)P21和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，放療是其主要的治療手段，但宮頸癌單純放療5年生存率只有50%左右，故提高宮頸癌放療敏感性在臨床上有著極其重要的意義。目前臨床上放療增敏劑主要是一些化療藥物，如順鉑、泰素等，但由于這些藥物對正常細(xì)胞的毒性作用較大，而且其與放療的毒性作用有協(xié)同作用，病人一般難以耐受。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等植物的根莖中提取出來的多元酚，其對慢性粒細(xì)胞白血病有獨(dú)特的療效[1]，本課題組前期發(fā)現(xiàn)其尚對體外培養(yǎng)的人宮頸癌Hela細(xì)胞具有放射增敏作用[2]，但其作用機(jī)制不詳，本文對此進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞（湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床研究所）；姜黃素（HPLC>98%，成都思科華生物技術(shù)有限公司，用DMSO溶解配成1mg/mL的母液備用，使用前用10%RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度）；小鼠抗人Bc1-2、P21、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；Clinac 600C/D加速器（ 美國Varian 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及照射條件 人宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于含5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)，所有照射均為室溫下照射，射線劑量率為40cGy/min。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測P21、Bcl-2蛋白 將Hela細(xì)胞接種于加有蓋玻片的2個6孔板中，分為空白組、As2O3組、單放組、藥放組，每個組設(shè)3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后姜黃素組和藥放組加藥， 終濃度2umol/L，給藥24小時后單放及藥放組接受2Gy放療，24小時后取出蓋破片，以PBS（pH=7.5）沖洗，3min/次，沖洗三次后，放入4%多聚甲醛中固定20min，以PBS （pH=7.5） 沖洗， 3min/次，沖洗三次后，0.1%Triton X-100（ PBS緩沖液中含檸檬酸鈉0.1%）

透膜5min，以PBS （pH=7.5）沖洗，3min/次，沖洗三次后， 3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育10min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，按免疫試劑盒操作說明逐步進(jìn)行，一抗工作濃度1：100，DAB室溫顯色15-20 min（顯微鏡下控制），自來水沖洗，中性樹脂封片，顯微攝影計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)以x±s形式表示，SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析， P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P<0.01為差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Bcl-2蛋白 鏡下可見，Bcl-2主要位于細(xì)胞質(zhì)中，少許分布于胞膜中，為粗細(xì)不等的棕黃色顆粒，放射及姜黃素均能降低Bcl-2的表達(dá)，二者聯(lián)合效果更明顯（P〈0.01），見表1。

3 討論

姜黃素是植物姜黃中的主要活性成分，具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗血管新生以及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。本課題組前期將姜黃素同步放射線照射用于體外觀察對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用姜黃素，細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度的增加成正比；單純應(yīng)用放射線照射，細(xì)胞抑制率也隨射線劑量的增加而增加，但當(dāng)輻射劑量達(dá)到12Gy時細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到坪臺期，不再隨射線劑量的加大而增加，在單純輻射劑量已達(dá)到“閾值”的情況下，聯(lián)用姜黃素可使細(xì)胞增殖抑制效果得到進(jìn)一步的提高，且對細(xì)胞增殖的抑制率高于單純放射組和單純藥物組，說明同步應(yīng)用姜黃素確實(shí)可對宮頸癌細(xì)胞放療產(chǎn)生增效的作用，這與常萍等人觀察的順鉑對宮頸癌放療增敏作用特點(diǎn)相一致[3]。

為進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測了細(xì)胞內(nèi)p2l和Bcl-2兩蛋白的改變，p2l蛋白是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白家族成員，其功能主要是通過抑制細(xì)胞周期調(diào)控因子與細(xì)胞周期蛋白形成復(fù)合物，從而發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制作用，同時p2l又能抑制增殖細(xì)胞核抗原活性，從而直接抑制DNA的合成，有研究表明p2l基因的表達(dá)上調(diào)與放射敏感性增高密切相關(guān)。Bcl-2即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，是第一個被發(fā)現(xiàn)的能抑制多種細(xì)胞凋亡的原癌基因，也是最重要的凋亡調(diào)節(jié)因子之一，可通過調(diào)節(jié)線粒體的功能來調(diào)節(jié)凋亡，有文獻(xiàn)報道Bcl-2基因的表達(dá)下調(diào)與放射敏感性增加密切相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)放射及藥物均能提高p21表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，放射和藥物聯(lián)合作用效果更強(qiáng)。由此可推測，姜黃素放射增敏的機(jī)制可能是通過抑制Hela細(xì)胞的亞致死性損傷的修復(fù)、調(diào)整細(xì)胞周期的分布、上調(diào)p2l蛋白及下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。[基金項(xiàng)目]湖北醫(yī)藥學(xué)院第三臨床學(xué)院資助項(xiàng)目（201201）；湖北省十堰市科技局基金資助項(xiàng)目（ZD2012026）

參考文獻(xiàn)

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[2]張莉，鄧守恒，李芳，等. 姜黃素體外同步放療對宮頸癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，42（4）：369-371.

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