摘要：目的 檢測DcR3基因在肺癌組織中的表達，探討該基因在肺癌發(fā)病中的意義。方法 采用SP免疫組織化學(xué)方法檢測60例肺癌組織（實驗組）及60例正常肺組織（對照組）中DcR3基因的表達水平。結(jié)果 在60例肺癌組織中，DcR3基因的陽性表達率分別為68.33%，在60例正常肺組織中，其陽性表達率為45.2%，DcR3基因在兩組組織中的表達均有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論DcR3基因在肺癌組織中的表達顯著高于正常組織，它可能是一個引起肺癌發(fā)病的癌基因，可能作為一個反映肺癌惡性程度的指標。

關(guān)鍵詞：DcR3基因 肺癌 表達

中圖分類號：R563 文獻標識碼：A 文章編號：1005-0515（2013）8-036-02

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，居美國腫瘤死因首位。根據(jù)全國疾病監(jiān)測系統(tǒng)報告，自 1990 年起，中國人群的肺癌死亡率以每年 4.5%的速度上升，估計在未來還會上升的更快。由于肺癌5 年存活率很低，僅為10%～15%[1]，所以研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療已成為當前的一個研究熱點，尤其是肺癌發(fā)生的分子生物學(xué)方面的機制研究成果顯著，極大地豐富了對肺癌發(fā)生過程的認識。可溶性誘惑受體（decoy receptor 3，DcR3）具有幫助腫瘤的發(fā)生，發(fā)展和逃避免疫攻擊的作用。目前國內(nèi)外已經(jīng)檢查了許多惡性腫瘤 ， 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 了 大 多 數(shù) 惡 性 腫 瘤 均 表 達 DcR3基因[2-3-4-5-6]。本實驗主要通過測定DcR3基因在肺癌和正常肺組織中的表達，說明DcR3基因在肺癌發(fā)生過程中可能起著重要作用，可能作為一個反映肺癌惡性程度的指標。

1 研究對象

選用我院2000年1月至2012年12月間60例肺癌病例，其中男性35例，女性25例，年齡29-79歲，中位年齡56歲，均經(jīng)手術(shù)病理、纖維支氣管鏡細胞學(xué)及組織學(xué)診斷明確。其中鱗癌30例，腺癌12例，小細胞癌9例，肺泡細胞癌5例，混合癌2例，大細胞癌2例，均未接受化療、放療及其他抗癌治療。所有病例均進行詢問病史、查體、胸片、胸部CT、腹部B超及同位素骨掃描，部分病例進行頭顱或腹部CT掃描，根據(jù)1997年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分期標準進行TMN分期。標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋。隨訪時間3-36月。

2 主要試劑

SP免疫組化染色試劑盒，為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；抗人DcR3單克隆抗體（mAb）自行制備。

3.實驗方法

1將切片依次浸入盛有二甲苯、梯度酒精的玻璃缸中脫蠟后水化（二甲苯Ⅰ30分鐘→二甲苯Ⅱ15分鐘→二甲苯Ⅲ15分鐘→100%乙醇Ⅰ3分鐘→100%乙醇Ⅱ3分鐘→95%乙醇3分鐘→75%乙醇3分鐘→蒸餾水沖洗→lx PBS再洗一次）。

2 3%H2O2（90%1xPBS+10ml 30% H2O2配制）室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，1xPBS沖洗5分鐘x2次。

3.將切片置于修復(fù)架上，浸入盛有0.01M構(gòu)椽酸鈉緩沖液（PH6.0）的燒杯中，高火加熱至90攝氏度后記時2分鐘，然后轉(zhuǎn)至解凍10分鐘，接著將燒杯端離熱源，室溫冷卻20一30分鐘，取出切片，蒸餾水沖洗，1xPBS沖洗5分鐘x3次。

4.滴加10%正常羊血清37攝氏度封閉孵育1小時，傾去血清，勿洗以封閉非特異性背景著色。

5滴加抗人DcR3單克隆抗體，4攝氏度孵育過夜。

6第二天從冰箱中取出標本，恢復(fù)至室溫后1xPBS沖洗5分鐘x3次。

7滴加生物素標記的羊抗鼠二抗，37.C孵育1小時，1xPBS沖洗5分鐘x3次。

8.滴加辣根過氧化物酶標記的三抗鏈霉卵白素，37攝氏度孵育1小時，lxPBS沖洗5分鐘x3次。

9用新配制（1xPBSlml+微量的DAB+1ūl 30% H2O2）的DAB〔5%v/v）避光顯色5-15分鐘，于光學(xué)顯微鏡下觀察，有信號時可用自來水沖洗終止反應(yīng)，10%蘇木素稍稍襯染（自來水沖洗），1%鹽酸一酒精分色（可滴片并直接浸泡在lx PBS里，然后用水沖洗）。

10.逐級酒精脫水，二甲苯透明（75%乙醇3分鐘→95%乙醇3分鐘→100%乙醇I 3分鐘→100%乙醇Ⅱ3分鐘→二甲苯I 3分鐘→二甲苯Ⅱ3分鐘）。

11.中性樹膠加蓋玻片封片。

12.加一抗時把對照片用1XPBS代替IA6抗體分別作實驗組和對照組對照。

4.結(jié)果判定

每例標本選擇9個高倍鏡視野（40X，向同一方向移動切片，不重復(fù)，不重疊，細致觀察），按陽性細胞數(shù)占視野中總細胞數(shù)的百分比3級（一）：無陽性著色或陽性細胞數(shù)<5%為陰性；（+）：陽性細胞數(shù)在5%-50%之間為陽性；（++）：陽性細胞數(shù)>5%0為強陽性\"計算陽性率時以（/一）與（0一+）之和為總陽性細胞數(shù)。結(jié)果判定采用雙盲對照法。

5統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，用x2檢驗及等級相關(guān)性分析進行數(shù)據(jù)處理P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

6 結(jié)果

在60例肺癌組織中，DcR3基因的陽性表達數(shù)目為41例，陽性表達率為（41/60）68.33%，在60例正常肺組織中，其陽性表達數(shù)目為27例，陽性表達率為45.2%。DcR3基因在兩組組織中的表達均有顯著性差異（P<0.05）。

7 討論

肺癌可以分為兩大類：（一）非小細胞肺癌。1，鱗狀上皮細胞癌（簡稱鱗癌）包括梭形細胞癌。典型的鱗癌細胞大， 呈多形性，胞漿豐富，有角化傾向，核畸形，染色深，細胞間橋多見，常呈鱗狀上皮樣排列。分化較好，惡性度較低。2，腺癌，包括腺泡狀腺癌、乳頭狀腺癌、細支氣管-肺泡細胞癌、實體癌粘液形成。典型的腺癌呈腺管或乳頭狀結(jié)構(gòu)，細胞大小比較一致，圓形或橢圓形，胞漿豐富，常含有粘液，核大，色深，常有核仁，核膜比較清楚。3，大細胞癌，包括巨細胞癌、透明細胞癌。細胞較大，大小不一，常呈多角形或不規(guī)則形，呈實行巢狀排列，常見大片出血性壞死，核大，核仁明顯，核分裂象常見，胞漿豐富。4，其他 腺鱗癌、類癌、支氣管腺體癌等。（二）小細胞肺癌，包括燕麥細胞型、中間細胞型、復(fù)合燕麥細胞型。癌細胞多為類圓形或菱形，胞漿少，類似淋巴細胞。分化差，惡性度最高。DcR3 的表達量與腫瘤的惡性度及組織類型有關(guān)。從 DcR3 的作用機制上看，它與腫瘤的發(fā)生，腫瘤的免疫逃避具有密切的聯(lián)系，根據(jù) DcR3 的這種表達特點，我們可已通過對它表達量作出初步的組織類型判斷，從而來指導(dǎo)臨床的診斷，治療，預(yù)后評價及腫瘤復(fù)發(fā)。

參考文獻：

1.BynleKJ，CoxqSwinsonD.Towardstagemodel for perabel non-small LungCaneer，2001：34：583-89

2 Shi G， Wu Y， Zhang J. Death decoy receptor TR6/DcR3 inhibitsT-cell chemotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 2003 Oct1，171（7）：3407-14.

3 Hosoe， S.，Kawaguchi， T.； Naka， Y.； Genomic amplificationof a decoy receptor for Fas ligand （DcR3） in lung cancers at various clinical stages，Lung Cancer Volume： 29， Issue： 1，Supplement 1， September， 2000， 196.

4 Hwang SL， Lin CL， Cheng .Serum concentration of soluble decay receptor 3 in glioma patients before and after surgery. Kaohsiung J Med Sci. 2004 Mar，20（3）：124-7.

5. Shi G， Mao J， Yu G. Tumor Vaccine Based on Cell Surface Expression of DcR3/TR6. J Immunol. 2005 Apr 15，174（8）：4727-35.

6. Fujita Y， Sakakura C， Shimomura K. Chromosome arm 20qgains and other genomic alterations in esophageal squamous cell C arcinoma， as analyzed by comparative genomic hybridization and

fluorescence in situ hybridization. Hepatogastroenterology. 2003 Nov-Dec，50（54）：1857-63.