摘要：目的 檢測(cè)M-CSF（macrophage colony-stimulating factor）巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)1，25二羥基膽鈣化醇（1，25（OH）2D3）誘導(dǎo)形成的破骨樣細(xì)胞噬骨能力的影響。 方法 加入M-CSF及1，25二羥基膽鈣化醇（1，25（OH）2D3）誘導(dǎo)該大鼠骨髓單核細(xì)胞生成破骨樣細(xì)胞，對(duì)照組只加1，25二羥基膽鈣化醇誘導(dǎo)該大鼠骨髓單核細(xì)胞生成破骨樣細(xì)胞。用甲苯胺蘭染色鑒定破骨細(xì)胞嗜骨能力。 結(jié)果 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞TRAP 染色陽性。甲苯胺蘭染色顯示破骨樣細(xì)胞在骨片上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生一定面積及深度的骨陷凹。 結(jié)論M-CSF組形成的破骨樣細(xì)胞在特異酶及噬骨能力與對(duì)照組無差異。

關(guān)鍵詞：破骨細(xì)胞；培養(yǎng)；誘導(dǎo)；鑒定

中圖分類號(hào)：R816.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-0515（2013）8-023-02

材料和方法

1 動(dòng)物及藥品

新生24 h Wistar大鼠（沈陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部）， 1， 25 （ OH ） 2 D3 、胰蛋白酶、 萘酚AS-BI磷酸鈉、酒石酸甲鈉（Sigma）， DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（天津?yàn)螅?，EDTA，M-CSF（Sigma） 。

2 方法

2.1 薄骨磨片的制備及處理：

取新鮮成年牛股骨皮質(zhì)-20℃貯存。使用前用鋼鋸鋸成1 cm寬條后用磨片機(jī)磨成厚50μm的 1 cm×1 cm骨片 ，蒸餾水中清洗 10次 ，置于75%酒精中，侵泡24 h，自然晾干 ，在超凈臺(tái)內(nèi)骨片兩面紫外線照射消毒后放于DMEM 液中4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 M-CSF與1，25（OH）2D3誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞的生成：

出生24 h內(nèi)的新生大鼠斷頸處死，無菌取其四肢長(zhǎng)骨，在無菌PBS液中去凈附著在其表面的軟組織（盡可能去其所有組織）。將其骨干在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，4umol/L谷氨酰胺）中去除兩干骺端，然后縱行剖開，刮骨髓腔內(nèi)表面直至骨干成為極為微小的碎片，用300目篩網(wǎng)濾過，用吸管反復(fù)多次輕吹洗篩網(wǎng)上殘?jiān)?，吸取濾過懸液置離心管內(nèi)，4℃ 1000 r/min離心10 min，棄上清，加4 m1 DMEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育20 h。輕吸取培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液于離心管內(nèi)，PBS液沖洗培養(yǎng)皿2遍，將洗滌下的液體也置于離心管內(nèi)。0.05 %胰蛋白酶/0.02% EDTA聯(lián)合消化培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞5 min，將消化下的細(xì)胞也置入上述離心管內(nèi)。PBS液沖洗培養(yǎng)皿2遍，DMEM終止胰蛋白酶的作用。倒置相差顯微鏡觀察，如殘留的單核細(xì)胞較多可重復(fù)所有上述操作。將上述收集于離心管內(nèi)的細(xì)胞，在4℃ 1000 r/min下離心10 min，棄上清，加適量DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度約2x106/ml左右，將細(xì)胞接種于24孔板中，其中24孔板內(nèi)置1x1cm2骨片，使細(xì)胞接種密度為2 x 106/cm2。使含1，25（OH）2D3組終濃度為10-8M[4]。分成M-CSF組和對(duì)照組，M-CSF組中加M-CSF使其終濃度為20ng/ml，置37 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔日換液1次。

2.3 骨吸收陷窩定量分析

2.3.1 骨片吸收陷窩記數(shù)：

參考高建軍等方法[5]分別于3，6，9 d取出對(duì)照組和M-CSF組培養(yǎng)板中的骨片各四張，2.5%戊二醛固定7 min，與0.25mol/L氫氧化銨中超聲波清洗5 minX3次，系列梯度酒精脫水，自然涼干，1%甲苯胺藍(lán)染液室溫染色3～4min，蒸餾水清洗，于100倍光鏡下對(duì)整張骨片上的吸收陷窩記數(shù)。

2.3.2 吸收陷窩面積分析：

以上各組經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色骨片于400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝照片，采用計(jì)算機(jī)Meta Morph /Dp10 /Bx41分析系統(tǒng)勾畫出骨陷窩輪廓，計(jì)算并比較各組陷窩面積。

2.3.3 吸收陷窩深度分析：

以上各組經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色骨片于400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝照片，由于陷窩著色深淺與其深度有關(guān)，采用計(jì)算機(jī)MetaMorph/Dp10 /Bx41分析系統(tǒng)分析計(jì)算各組骨片上陷窩染色的平均光密度值，并以此比較各組陷窩深度的差異。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以ˉX ±s 表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 1110 軟件進(jìn)行，多組比較用one way ANOVA 方差分析，組間比較用q 檢驗(yàn)；兩組比較用t 檢驗(yàn)。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

3.1吸收陷窩個(gè)數(shù)分析

從表3可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與M-CSF組陷窩深度逐漸擴(kuò)大，在3d、6d、9d時(shí)，對(duì)照組與M-CSF組之間經(jīng)雙側(cè)t檢驗(yàn)分析（p>0.05），說明兩組間吸收陷凹深度沒有差異。

討論

破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)見于80年代，1982年Chamber首次從乳兔四肢骨分離培養(yǎng)出成熟破骨細(xì)胞[1]，為骨吸收的體外研究奠定了基礎(chǔ)。我國(guó)于世風(fēng)等[2 ]1988年率先引進(jìn)了破骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法并加以改良[3 ]。后來發(fā)現(xiàn)用1， 25 （ OH ） 2 D3誘導(dǎo)單核細(xì)胞形成破骨樣細(xì)胞。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，破骨細(xì)胞屬單核/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，受多種基本調(diào)控的細(xì)胞因子的直接或間接刺激作用，經(jīng)增殖、分化、生存與融合發(fā)育為多核的成熟破骨細(xì)胞，最后被活化[6]。最新的理論認(rèn)為，在諸多調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和形成及其骨吸收的因素中，能直接作用于破骨細(xì)胞的只有一對(duì)既相互促進(jìn)又相互制約的偶聯(lián)因子—破骨細(xì)胞分化因子（RANKL/ODF/OPGL/TRANCE）和破骨細(xì)胞形成抑制因子暨護(hù)骨素（OPG/OCIF）[7，8]。它們與破骨細(xì)胞膜上的RANK一道構(gòu)成一個(gè)三因子系統(tǒng)。該系統(tǒng)在骨代謝的調(diào)節(jié)中具有極其重要的作用。調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、形成和吸收的眾多因子如PTH1α、1，25-（OH）2D3、IL等都是直接作用于成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)這兩個(gè)因子的濃度增加與減少，進(jìn)而間接地完成它們的調(diào)節(jié)功能。

而1 ，25 （OH） 2D3 被證明是一種很強(qiáng)的骨吸收刺激因子，是維生素D 受體通路的代表因子，參與破骨細(xì)胞的形成及激活過程。目前國(guó)內(nèi)所用的大鼠骨髓源性破骨細(xì)胞培養(yǎng)，主要以1 ，25 （OH） 2D3作為誘導(dǎo)物[5 ，6 ] 。由于骨髓干細(xì)胞1 ，25 （OH） 2D3 誘導(dǎo)培養(yǎng)體系需要成骨細(xì)胞支持，造成破骨細(xì)胞分離純化困難，所以這種方法比較適用于研究破骨細(xì)胞分化發(fā)育過程中細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，而不適合用于對(duì)細(xì)胞純度要求較高的破骨細(xì)胞分泌蛋白檢測(cè)、生化和分子生物研究。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）也稱為集落刺激因子-1（CSF-1），是一種具有譜系特異性的細(xì)胞因子。M-CSF為鏈間二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，主要存在于骨髓腔內(nèi)，對(duì)單核細(xì)胞的增殖、分化及維持其活性有重要作用。其受體為c-Fms。M-CSF是破骨細(xì)胞代謝過程中的關(guān)鍵因子，具有促進(jìn)破骨細(xì)胞對(duì)骨吸收的作用。M-CSF對(duì)骨代謝的主要作用之一是上調(diào)破骨系統(tǒng)。HaynesDR等研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞和成骨細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)系中，伴隨著破骨細(xì)胞的形成，出現(xiàn)M-CSF高表達(dá)；如果阻斷M-CSF與其受體的結(jié)合，可顯著減少破骨細(xì)胞的數(shù)目。M-CSF調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性骨骼形成之后即處于不斷的成骨破骨的動(dòng)態(tài)平衡中，破骨細(xì)胞的骨吸收活性維持并促進(jìn)骨的更新與生長(zhǎng)。成骨細(xì)胞合成和分泌的M-CSF不僅誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，對(duì)調(diào)節(jié)骨吸收活性也有重要作用。在小鼠骨髓/脾細(xì)胞和成骨/基質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，1，25（OH）2D3和Dex等鈣調(diào)節(jié)因子可激活成骨/基質(zhì)細(xì)胞生成大量的巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），后者作用于前破骨細(xì)胞，從而誘導(dǎo)這些細(xì)胞的增殖和分化。M-CSF已被證實(shí)是破骨細(xì)胞生成的必要條件。此外，Lacey DL等在實(shí)驗(yàn)中還觀察到，經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)的骨髓培養(yǎng)細(xì)胞中可形成大量能被OPGL結(jié)合的細(xì)胞，這些細(xì)胞形態(tài)類似前破骨細(xì)胞，體外可經(jīng)誘導(dǎo)形成具有吸收功能的成熟破骨細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)破骨細(xì)胞生物作用的研究進(jìn)展

醫(yī)藥科學(xué)綜合> 《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)》> 2004年6月32卷3期>論著> 文章詳情 巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)破骨細(xì)胞生物作用的實(shí)驗(yàn)研究

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