【摘要】 目的：探討P16基因在腦血管畸形（CVM）及正常腦組織中的表達(dá)情況，討論其臨床病理意義。方法：收集腦血管畸形標(biāo)本，利用免疫組化方法測定P16蛋白在正常腦組織及腦血管畸形中的表達(dá)情況。結(jié)果：在腦血管畸形標(biāo)本及正常腦組織標(biāo)本中P16蛋白陽性表達(dá)率分別為32.1%（18/56）及7.4%（2/27），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P16蛋白在海綿狀血管瘤中的表達(dá)率高于動(dòng)靜脈畸形中的表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：P16基因在腦血管畸形（CVM）的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

【關(guān)鍵詞】 P16； 基因； 腦血管畸形； 免疫組織化學(xué)

在炎癥、腫瘤等情況下，可以引起血管生成（angiogenesis），血管生成生成的過程中有多種因素參與，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及細(xì)胞周期控制蛋白等[1-2]。目前腦血管畸形的形成過程尚不明確，但是血內(nèi)皮細(xì)胞的增殖在腦血管畸形的形成過程中起著重要的作用[3]。

筆者應(yīng)用免疫組化方法檢測P16蛋白在腦血管畸形患者標(biāo)本及正常腦組織中的表達(dá)情況，并分析其臨床病理意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集東莞市虎門醫(yī)院及延大附院病理科1995年1月-2012年12月期間進(jìn)行手術(shù)的腦血管畸形患者標(biāo)本（56例），男女比例（32：34），平均年齡27.2歲（18～42歲），其中動(dòng)靜脈畸形37例，海綿狀血管瘤19例。對(duì)照組為27例正常腦組織進(jìn)行顱內(nèi)減壓的患者，。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及免疫組織化學(xué)方法 P16單克隆抗體（即用型）及二抗檢測試劑盒均購自邁新公司。所有標(biāo)本取材厚度為3 mm，取材后采用10%中性福爾馬林固定，固定時(shí)間為12 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，烤片1 h（70 ℃），烤片后采用二甲苯脫蠟，所有切片應(yīng)用檸檬酸進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)處理，加一抗后保濕盒內(nèi)常溫孵育1 h，PBS緩沖液沖洗，二抗常溫孵育0.5 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。每批切片實(shí)驗(yàn)均設(shè)立明確的陽性對(duì)照及陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) （1）病理醫(yī)生在奧林帕斯BX50顯微鏡下進(jìn)行評(píng)估所有免疫組化玻片。（2）P16蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核，細(xì)胞核出現(xiàn)淡黃色、黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。（3）隨機(jī)選取10個(gè)40×10高倍視野，進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。（4）評(píng)估陽性細(xì)胞百分率及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度。Ⅰ：陽性細(xì)胞百分率：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。Ⅱ：染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分及黃褐色3分。Ⅰ×Ⅱ≥3分為陽性，<3分為陰性[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在55例腦血管畸形患者免疫組化切片中P16蛋白的陽性表達(dá)為18例（32.1%）高于在27例正常腦組織免疫組化切片中的表達(dá)2例（7.4%），表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=6.09，P=0.014）；在腦血管畸形的患者中P16蛋白在海綿狀血管瘤中的表達(dá)高于在動(dòng)靜脈畸形中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)一個(gè)與P53同樣重要的P16抑癌基因，它的突變或缺失參與了多種腫瘤的形成[5-7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖在腦血管畸形的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[8]。細(xì)胞的增殖周期受相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控，如果細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常，細(xì)胞的增殖狀態(tài)也將進(jìn)入異常。Pl6基因是參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因之一，它是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控蛋白，可以阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[9]。P16基因通過突變、缺失及甲基化的形式失活，從而喪失對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的作用[10]。P16基因的失活意味著P16的低表達(dá)，但是在許多研究中卻發(fā)現(xiàn)：存在甲基化的P16基因失活，與P16蛋白的表達(dá)明顯相關(guān)，其機(jī)制可能增殖失控的細(xì)胞反饋性提高P16蛋白的表達(dá)[11]。筆者的研究結(jié)果與之類似：在56例腦血管畸形患者免疫組化切片中P16蛋白的陽性表達(dá)率為32.1%（18/56）高于在27例正常腦組織免疫組化切片中的表達(dá)率為7.4%（2/27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)，在腦血管畸形的患者中P16蛋白在海綿狀血管瘤中的表達(dá)高于在動(dòng)靜脈畸形中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明：P16基因參與了腦血管畸形的發(fā)生發(fā)展過程，P16蛋白的表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖正相關(guān)，在海綿狀血管瘤中的表達(dá)率高于動(dòng)靜脈畸形中的表達(dá)率，其機(jī)制可能是增殖失控的血管內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)反饋提高了P16蛋白的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1] Carmeliet P.Angiogenesis in life，disease and medicine[J].Nature，2005，438（14）：932-936.

[2]楊延莉，魏茂富，劉鏡文.腦血管畸形患者VEGF的表達(dá)及臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（11）：156-157.

[3] Jabbour M N，Elder J B，Samuelson C G，et al.Aberrant angiogenic characteristics of human brain arteriovenous malformation endothelial cells[J].Neurosurgery，2009，64（1）：139-146.

[4] Liu W H，Kaur M，Wang G，et al.Inverse PCR-based RFLP scanning identifies low-level mutation signatures in colon cell and turmors[J].Cancer Res，2004，64（7）：2544-2551.

[5] Xing C，Wang Q F，Li B，et a1.Methylation and expression analysis of tumor suppressor genes p15 and p16 in benzene poisoning[J].Chem Biol Interact，2010，184（1-2）：306-309.

[6] Rajcdni J，Adamkov M，Hybenovd J，et a1.Detection of regulatory protein pl6/INK4A in the dysplastic cervical squamous cell epithelium is a diagnostic tool for carcinoma prevention[J].Cesk Patol，2009，45（4）：101-107.

[7]胡愛俠，孫淼淼，陳奎生.HER-2、p16、p53蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28（9）：959-962.

[8] Moftakhar P，Hauptman J S，Malkasian D，et al.Cerebral arteriovenous malformations.Part 1：cellular and molecular biology[J].Neurosurg Focus，2009，26（5）：E10.

[9] Marina M C，Mogo D G，Simionescu C E，et al.The study of p53 and p16 immuno expression in serous borderline and malignant ovarian tumors[J].Morphol Embryol，2012，53（4）：1021-1025.

[10] Goto T，Mizukami H，Shirahata A，et al.Aberrant methylation of the p16 gene is frequently detected in advanced colorectal cancer[J].Anticancer Res，2009，29（1）：275-277.

[11] Kang S，Kim J，Kim H B，et a1.Methylation of p16INK4a is a nonrare event in cervical intraepithelial neoplasia[J].Diagn Mol Pathol，2006，15（2）：74-82.

（收稿日期：2013-02-19） （本文編輯：連勝利）