【摘要】 目的：比較新型甲型H1N1流感病毒分離株HA、NA氨基酸序列之間的差異，分析HA、NA蛋白可能的抗原性細(xì)胞表位。方法：從GenBank中選取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分離株并下載各株HA、NA的氨基酸序列；使用Clustal X和MEGA 2.0軟件對(duì)氨基酸序列的進(jìn)行進(jìn)化樹分析；用Protean軟件預(yù)測(cè)HA、NA蛋白的B細(xì)胞表位；用NetMHCⅡ 2.2預(yù)測(cè)T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果：世界范圍的毒株之間氨基酸序列相對(duì)保守，HA及NA均只有少數(shù)位點(diǎn)的變異，HA蛋白氨基酸序列之間較NA蛋白氨基酸序列之間變異較大；預(yù)測(cè)HA蛋白具有8個(gè)B細(xì)胞表位和10個(gè)T細(xì)胞表位；NA蛋白有12個(gè)B細(xì)胞表位和7個(gè)T細(xì)胞表位。結(jié)論：HA、NA蛋白的少數(shù)區(qū)域抗原性相對(duì)比較穩(wěn)定，可以作為檢測(cè)以及疫苗研究的靶區(qū)域。

【關(guān)鍵詞】 H1N1流感病毒； 抗原表位； 血凝素； 神經(jīng)氨酸酶

2009年4月，在美國首次報(bào)道了兩例感染新型甲型H1N1流感病毒患者[1]，同時(shí)在墨西哥出現(xiàn)了呼吸道感染的流行[2]。美國爆發(fā)的甲型H1N1流感迅速在北美洲地區(qū)蔓延，并很快波及亞洲、歐洲。新型甲型H1N1流感病毒是由禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的基因片段間的變異或重組產(chǎn)生的[3]，已經(jīng)引起世界性的大流行。

甲型H1N1流感能不斷引起流行是由于其抗原性不斷發(fā)生漂移所致[4]，其中最重要是血凝素（hemagglutinin，HA） 和神經(jīng)氨酸酶 （neuraminidase，NA） 的變異[5]。血凝素是流感病毒最重要的蛋白，它的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素。神經(jīng)氨酸酶是病毒囊膜表面的另一種重要的糖蛋白，在決定病毒毒力和宿主特異性方面也具有重要作用，與HA共為流感病毒亞型分型的主要依據(jù)，NA同時(shí)也是抗流感病毒的重要作用靶點(diǎn)[6]。目前，國內(nèi)雖然已經(jīng)開發(fā)了H1N1流感疫苗并接種了2000多萬人，但是，接種所致的不良反應(yīng)事例的出現(xiàn)同樣給健康的人們帶來了災(zāi)難。有針對(duì)性地改造毒素的相應(yīng)蛋白、獲得更為安全有效的疫苗成為解決問題的關(guān)鍵，而解析甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白的抗原性表位成為關(guān)鍵的突破口。

本研究分析了甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白抗原性變化的情況，并對(duì)其可能的抗原性表位進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，為新型甲型流感疫苗的制備提供依據(jù)，以便更有效及時(shí)地控制甲型流感的傳播。

1 材料與方法

1.1 新型甲型H1N1流感病毒株HA和NA基因序列與氨基酸序列 從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html）網(wǎng)站下載新近公布的新發(fā)甲型H1N1流感病毒的核酸序列與氨基酸序列。從不同國家和地區(qū)隨機(jī)挑選28株新型甲型H1N1流感病毒株來進(jìn)行接下來的序列比較和抗原性分析。

1.2 新型甲型H1N1流感病毒的細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 用Clustal X軟件分別對(duì)28例HA、NA氨基酸序列進(jìn)行多序列比較，然后使用MEGA 2.0的鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，分析彼此之間序列的變異大小。對(duì)比序列比對(duì)分析結(jié)果，選取其中代表性的序列作為基準(zhǔn)株，用Protean軟件對(duì)基準(zhǔn)序列的親水性、表面可能性、抗原指數(shù)進(jìn)行綜合分析，分析各指數(shù)值得到B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果；使用NetMHCⅡ 2.2在線表位預(yù)測(cè)服務(wù)器，選定服務(wù)器包含的所有MHC classⅡ等位基因，以9個(gè)連續(xù)氨基酸為測(cè)定單位，根據(jù)各序列與MHC classⅡ等位基因的親和能力不同，預(yù)測(cè)出其可能的T細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 新型甲型H1N1流感病毒分離株HA、NA氨基酸比較 用MEGA 2.0進(jìn)行進(jìn)化樹分析，所得結(jié)果見圖1、圖2。從圖1和2可以看出，28例HA以及NA氨基酸序列可以分為兩個(gè)大的族群，通過對(duì)這兩個(gè)族群的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HA氨基酸序列按220位氨基酸為蘇氨酸或者絲氨酸分為兩個(gè)族群；NA氨基酸序列按106位異亮氨酸突變成纈氨酸、248位天冬氨酸突變成天冬氨酰分成兩個(gè)大的族群；分別選取兩種蛋白的兩個(gè)族群中較有代表性的HA氨基酸序列CY046475與CY044869和NA氨基酸序列CY046477與GQ149691為基準(zhǔn)序列以便進(jìn)行下一步的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)。

圖1 28例甲型流感病毒H1N1 HA氨基酸序列進(jìn)化樹

2.2 Protean軟件分析基準(zhǔn)株HA、NA蛋白B細(xì)胞抗原性特征 用Plot-Kyte-Doolittle親水性[7]、Plot-Emini表面可能性[8]、Jameson-Wolf抗原指數(shù)[9]三參數(shù)綜合考慮預(yù)測(cè)方案進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，HA氨基酸序列CY046475與CY044869的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果并沒有明顯差別，同樣，NA氨基酸序列CY046477與GQ149691的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果也沒有

注：進(jìn)化樹后的名稱為GeneBank的登錄號(hào)

圖2 28例甲型流感病毒H1N1 NA氨基酸序列進(jìn)化樹

注：進(jìn)化樹后的名稱為GeneBank的登錄號(hào)

明顯差別，因此，只選取HA氨基酸序列CY046475和NA氨基酸序列CY046477的結(jié)果列出。對(duì)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)在HA蛋白中50-55、110-120、137-141、175-179、208-222、361-369、457-460、478-500各項(xiàng)指數(shù)均較高，提示可能是抗原性表位，見圖3。綜合各參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在NA蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425各項(xiàng)指數(shù)均較高，提示為抗原性表位，見圖4。

圖3 HA蛋白 （CY046475） B細(xì)胞表位分析結(jié)果

圖4 NA蛋白 （CY046477） B細(xì)胞表位分析結(jié)果

2.3 NetMHCⅡ 2.2軟件分析基準(zhǔn)株HA、NA蛋白T細(xì)胞抗原性特征 使用NetMHCⅡ 2.2在線T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)服務(wù)器分析了基準(zhǔn)株HA、NA蛋白T細(xì)胞抗原性表位，發(fā)現(xiàn)HA蛋白中8-16、41-49、61-69、96-104、155-169、215-223、259-267、309-331、346-354、532-542氨基酸區(qū)段抗原值較高，見圖5；NA蛋白中32-40、74-85、132-140、155-163、177-185、256-264、351-359氨基酸區(qū)域抗原值較高，見圖6，可能為T細(xì)胞抗原性表位。

圖5 HA蛋白 （CY046475） T細(xì)胞表位分析結(jié)果

注：縱坐標(biāo)的分值表示NetMHCⅡ 2.2軟件預(yù)測(cè)的9氨基酸滑動(dòng)肽與各MHC class Ⅱ等位基因的親和力大小

圖6 NA蛋白 （CY046477） T細(xì)胞表位分析結(jié)果

注：縱坐標(biāo)的分值表示NetMHCⅡ 2.2軟件預(yù)測(cè)的9氨基酸滑動(dòng)肽與各MHC class Ⅱ等位基因的親和力大小

3 討論

甲型（A）流感病毒（influenza virus A）基因組含有8個(gè)RNA片段[10]，第1、2、3個(gè)節(jié)段編碼的是RNA多聚合酶；第4個(gè)節(jié)段負(fù)責(zé)編碼血凝素（hemagglutinin， HA）蛋白；第5個(gè)節(jié)段負(fù)責(zé)編碼核蛋白（nucleoprotein， NP）；第6個(gè)節(jié)段編碼的是神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase， NA）；第7個(gè)節(jié)段編碼基質(zhì)蛋白（matrix protein， MP）；第8個(gè)節(jié)段編碼的是一種能起到拼接RNA功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，這種蛋白的其他功能尚不得而知。血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶被認(rèn)為是最重要的免疫原性位點(diǎn)[11]。

經(jīng)過對(duì)選自世界各國不同流感病毒株的HA、NA蛋白序列進(jìn)行Clustal X分析，發(fā)現(xiàn)不同株之間氨基酸序列相對(duì)保守。HA蛋白最具特征性的變異為220位氨基酸的差別，28株中有15株為絲氨酸和13株為蘇氨酸。對(duì)28例NA蛋白中有8例同時(shí)發(fā)生了106位異亮氨酸突變成纈氨酸、248位天冬氨酸突變成天冬氨酰?？傮w上來看，HA蛋白的變異性相對(duì)于NA蛋白較大。

利用Protean軟件對(duì)基準(zhǔn)株的HA、NA抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，聯(lián)合使用Kyte-Doolittle的親水性方案，Plot-Emini的蛋白質(zhì)表面可能性方案及Jameson-Wolf的抗原指數(shù)方案進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)HA蛋白有8段序列，NA蛋白有12段序列是可能的B細(xì)胞抗原表位。對(duì)220位氨基酸為蘇氨酸的HA蛋白和106位氨基酸為纈氨酸、248位為天冬氨酰的NA蛋白與未發(fā)生相應(yīng)變異的蛋白序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)并不影響HA、NA蛋白的B細(xì)胞表位特征。利用NetMHCⅡ 2.2軟件分析T細(xì)胞抗原表位也同樣發(fā)現(xiàn)，上述變異位點(diǎn)并不影響HA、NA蛋白的T細(xì)胞表位特征。根據(jù)以上分析，提示新型甲型H1N1流感病毒關(guān)鍵蛋白HA、NA的一些區(qū)域抗原性相對(duì)比較穩(wěn)定，可以作為檢測(cè)以及疫苗研發(fā)的靶區(qū)域。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)方法也得到了很大的進(jìn)步與廣泛的應(yīng)用，如表位疫苗的設(shè)計(jì)、新的診斷試劑開發(fā)等。但是細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)仍然不夠完善。目前，幾乎所有的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)的算法都是預(yù)測(cè)連續(xù)氨基酸組成的線性表位，而較少涉及構(gòu)象性表位的研究。本研究?jī)H是對(duì)新型H1N1流感病毒的HA和NA蛋白的細(xì)胞抗原性表位進(jìn)行初步篩選，預(yù)測(cè)結(jié)果需要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)結(jié)果來證實(shí)。

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（收稿日期：2013-03-28） （本文編輯：連勝利）