【摘要】 目的:比較新型甲型H1N1流感病毒分離株HA、NA氨基酸序列之間的差異,分析HA、NA蛋白可能的抗原性細(xì)胞表位。方法:從GenBank中選取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分離株并下載各株HA、NA的氨基酸序列;使用Clustal X和MEGA 2.0軟件對(duì)氨基酸序列的進(jìn)行進(jìn)化樹分析;用Protean軟件預(yù)測(cè)HA、NA蛋白的B細(xì)胞表位;用NetMHCⅡ 2.2預(yù)測(cè)T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果:世界范圍的毒株之間氨基酸序列相對(duì)保守,HA及NA均只有少數(shù)位點(diǎn)的變異,HA蛋白氨基酸序列之間較NA蛋白氨基酸序列之間變異較大;預(yù)測(cè)HA蛋白具有8個(gè)B細(xì)胞表位和10個(gè)T細(xì)胞表位;NA蛋白有12個(gè)B細(xì)胞表位和7個(gè)T細(xì)胞表位。結(jié)論:HA、NA蛋白的少數(shù)區(qū)域抗原性相對(duì)比較穩(wěn)定,可以作為檢測(cè)以及疫苗研究的靶區(qū)域。
【關(guān)鍵詞】 H1N1流感病毒; 抗原表位; 血凝素; 神經(jīng)氨酸酶
2009年4月,在美國首次報(bào)道了兩例感染新型甲型H1N1流感病毒患者[1],同時(shí)在墨西哥出現(xiàn)了呼吸道感染的流行[2]。美國爆發(fā)的甲型H1N1流感迅速在北美洲地區(qū)蔓延,并很快波及亞洲、歐洲。新型甲型H1N1流感病毒是由禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的基因片段間的變異或重組產(chǎn)生的[3],已經(jīng)引起世界性的大流行。
甲型H1N1流感能不斷引起流行是由于其抗原性不斷發(fā)生漂移所致[4],其中最重要是血凝素(hemagglutinin,HA) 和神經(jīng)氨酸酶 (neuraminidase,NA) 的變異[5]。血凝素是流感病毒最重要的蛋白,它的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素。神經(jīng)氨酸酶是病毒囊膜表面的另一種重要的糖蛋白,在決定病毒毒力和宿主特異性方面也具有重要作用,與HA共為流感病毒亞型分型的主要依據(jù),NA同時(shí)也是抗流感病毒的重要作用靶點(diǎn)[6]。目前,國內(nèi)雖然已經(jīng)開發(fā)了H1N1流感疫苗并接種了2000多萬人,但是,接種所致的不良反應(yīng)事例的出現(xiàn)同樣給健康的人們帶來了災(zāi)難。有針對(duì)性地改造毒素的相應(yīng)蛋白、獲得更為安全有效的疫苗成為解決問題的關(guān)鍵,而解析甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白的抗原性表位成為關(guān)鍵的突破口。
本研究分析了甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白抗原性變化的情況,并對(duì)其可能的抗原性表位進(jìn)行了分析預(yù)測(cè),為新型甲型流感疫苗的制備提供依據(jù),以便更有效及時(shí)地控制甲型流感的傳播。
1 材料與方法
1.1 新型甲型H1N1流感病毒株HA和NA基因序列與氨基酸序列 從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html)網(wǎng)站下載新近公布的新發(fā)甲型H1N1流感病毒的核酸序列與氨基酸序列。從不同國家和地區(qū)隨機(jī)挑選28株新型甲型H1N1流感病毒株來進(jìn)行接下來的序列比較和抗原性分析。
1.2 新型甲型H1N1流感病毒的細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 用Clustal X軟件分別對(duì)28例HA、NA氨基酸序列進(jìn)行多序列比較,然后使用MEGA 2.0的鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹,分析彼此之間序列的變異大小。對(duì)比序列比對(duì)分析結(jié)果,選取其中代表性的序列作為基準(zhǔn)株,用Protean軟件對(duì)基準(zhǔn)序列的親水性、表面可能性、抗原指數(shù)進(jìn)行綜合分析,分析各指數(shù)值得到B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果;使用NetMHCⅡ 2.2在線表位預(yù)測(cè)服務(wù)器,選定服務(wù)器包含的所有MHC classⅡ等位基因,以9個(gè)連續(xù)氨基酸為測(cè)定單位,根據(jù)各序列與MHC classⅡ等位基因的親和能力不同,預(yù)測(cè)出其可能的T細(xì)胞抗原表位。
2 結(jié)果
2.1 新型甲型H1N1流感病毒分離株HA、NA氨基酸比較 用MEGA 2.0進(jìn)行進(jìn)化樹分析,所得結(jié)果見圖1、圖2。從圖1和2可以看出,28例HA以及NA氨基酸序列可以分為兩個(gè)大的族群,通過對(duì)這兩個(gè)族群的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),HA氨基酸序列按220位氨基酸為蘇氨酸或者絲氨酸分為兩個(gè)族群;NA氨基酸序列按106位異亮氨酸突變成纈氨酸、248位天冬氨酸突變成天冬氨酰分成兩個(gè)大的族群;分別選取兩種蛋白的兩個(gè)族群中較有代表性的HA氨基酸序列CY046475與CY044869和NA氨基酸序列CY046477與GQ149691為基準(zhǔn)序列以便進(jìn)行下一步的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)。
圖1 28例甲型流感病毒H1N1 HA氨基酸序列進(jìn)化樹
2.2 Protean軟件分析基準(zhǔn)株HA、NA蛋白B細(xì)胞抗原性特征 用Plot-Kyte-Doolittle親水性[7]、Plot-Emini表面可能性[8]、Jameson-Wolf抗原指數(shù)[9]三參數(shù)綜合考慮預(yù)測(cè)方案進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè),HA氨基酸序列CY046475與CY044869的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果并沒有明顯差別,同樣,NA氨基酸序列CY046477與GQ149691的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果也沒有
注:進(jìn)化樹后的名稱為GeneBank的登錄號(hào)
圖2 28例甲型流感病毒H1N1 NA氨基酸序列進(jìn)化樹
注:進(jìn)化樹后的名稱為GeneBank的登錄號(hào)
明顯差別,因此,只選取HA氨基酸序列CY046475和NA氨基酸序列CY046477的結(jié)果列出。對(duì)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)在HA蛋白中50-55、110-120、137-141、175-179、208-222、361-369、457-460、478-500各項(xiàng)指數(shù)均較高,提示可能是抗原性表位,見圖3。綜合各參數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)在NA蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425各項(xiàng)指數(shù)均較高,提示為抗原性表位,見圖4。
圖3 HA蛋白 (CY046475) B細(xì)胞表位分析結(jié)果
圖4 NA蛋白 (CY046477) B細(xì)胞表位分析結(jié)果
2.3 NetMHCⅡ 2.2軟件分析基準(zhǔn)株HA、NA蛋白T細(xì)胞抗原性特征 使用NetMHCⅡ 2.2在線T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)服務(wù)器分析了基準(zhǔn)株HA、NA蛋白T細(xì)胞抗原性表位,發(fā)現(xiàn)HA蛋白中8-16、41-49、61-69、96-104、155-169、215-223、259-267、309-331、346-354、532-542氨基酸區(qū)段抗原值較高,見圖5;NA蛋白中32-40、74-85、132-140、155-163、177-185、256-264、351-359氨基酸區(qū)域抗原值較高,見圖6,可能為T細(xì)胞抗原性表位。
圖5 HA蛋白 (CY046475) T細(xì)胞表位分析結(jié)果
注:縱坐標(biāo)的分值表示NetMHCⅡ 2.2軟件預(yù)測(cè)的9氨基酸滑動(dòng)肽與各MHC class Ⅱ等位基因的親和力大小
圖6 NA蛋白 (CY046477) T細(xì)胞表位分析結(jié)果
注:縱坐標(biāo)的分值表示NetMHCⅡ 2.2軟件預(yù)測(cè)的9氨基酸滑動(dòng)肽與各MHC class Ⅱ等位基因的親和力大小
3 討論
甲型(A)流感病毒(influenza virus A)基因組含有8個(gè)RNA片段[10],第1、2、3個(gè)節(jié)段編碼的是RNA多聚合酶;第4個(gè)節(jié)段負(fù)責(zé)編碼血凝素(hemagglutinin, HA)蛋白;第5個(gè)節(jié)段負(fù)責(zé)編碼核蛋白(nucleoprotein, NP);第6個(gè)節(jié)段編碼的是神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA);第7個(gè)節(jié)段編碼基質(zhì)蛋白(matrix protein, MP);第8個(gè)節(jié)段編碼的是一種能起到拼接RNA功能的非結(jié)構(gòu)蛋白,這種蛋白的其他功能尚不得而知。血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶被認(rèn)為是最重要的免疫原性位點(diǎn)[11]。
經(jīng)過對(duì)選自世界各國不同流感病毒株的HA、NA蛋白序列進(jìn)行Clustal X分析,發(fā)現(xiàn)不同株之間氨基酸序列相對(duì)保守。HA蛋白最具特征性的變異為220位氨基酸的差別,28株中有15株為絲氨酸和13株為蘇氨酸。對(duì)28例NA蛋白中有8例同時(shí)發(fā)生了106位異亮氨酸突變成纈氨酸、248位天冬氨酸突變成天冬氨酰??傮w上來看,HA蛋白的變異性相對(duì)于NA蛋白較大。
利用Protean軟件對(duì)基準(zhǔn)株的HA、NA抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),聯(lián)合使用Kyte-Doolittle的親水性方案,Plot-Emini的蛋白質(zhì)表面可能性方案及Jameson-Wolf的抗原指數(shù)方案進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)HA蛋白有8段序列,NA蛋白有12段序列是可能的B細(xì)胞抗原表位。對(duì)220位氨基酸為蘇氨酸的HA蛋白和106位氨基酸為纈氨酸、248位為天冬氨酰的NA蛋白與未發(fā)生相應(yīng)變異的蛋白序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)并不影響HA、NA蛋白的B細(xì)胞表位特征。利用NetMHCⅡ 2.2軟件分析T細(xì)胞抗原表位也同樣發(fā)現(xiàn),上述變異位點(diǎn)并不影響HA、NA蛋白的T細(xì)胞表位特征。根據(jù)以上分析,提示新型甲型H1N1流感病毒關(guān)鍵蛋白HA、NA的一些區(qū)域抗原性相對(duì)比較穩(wěn)定,可以作為檢測(cè)以及疫苗研發(fā)的靶區(qū)域。
隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展,細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)方法也得到了很大的進(jìn)步與廣泛的應(yīng)用,如表位疫苗的設(shè)計(jì)、新的診斷試劑開發(fā)等。但是細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)仍然不夠完善。目前,幾乎所有的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測(cè)的算法都是預(yù)測(cè)連續(xù)氨基酸組成的線性表位,而較少涉及構(gòu)象性表位的研究。本研究?jī)H是對(duì)新型H1N1流感病毒的HA和NA蛋白的細(xì)胞抗原性表位進(jìn)行初步篩選,預(yù)測(cè)結(jié)果需要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)結(jié)果來證實(shí)。
參考文獻(xiàn)
[1] Centers for Disease Control and Prevention. Update: swine influenza A (H1N1) infections-California and Texas, April 2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2009,58(16):435-437.
[2] Centers for Disease Control and Prevention. Update: novel influenza A (H1N1) virus infection - Mexico, March-May,2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2009,58(21):585-589.
[3] Zimmer S M and D S Burke.Historical perspective-Emergence of influenza A (H1N1) viruses[J].N Engl J Med,2009,361(3):279-285.
[4] Hajjar L A, Schout D, Galas F R, et al. Guidelines on management of human infection with the novel virus influenza A (H1N1)-a report from the Hospital das Clinicas of the University of Sao Paulo[J].Clinics (Sao Paulo),2009,64(10):1015-1024.
[5] Machala M K and L B Brydak.Various sides of influenza, part I-structure,replication,changeability of influenza viruses, clinical course of the disease, immunological response and laboratory diagnostics[J].Pol Merkur Lekarski,2006,21(123):270-276.
[6] Su C Y, Wang S Y, Shie J J, et al. In vitro evaluation of neuraminidase inhibitors using the neuraminidase-dependent release assay of hemagglutinin-pseudotyped viruses[J].Antiviral Res,2008,79(3):199-205.
[7] Kyte J and Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol,1982,157(1):105-132.
[8] Karplus P A and Schulz G E.Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from refined enzyme:substrate crystal structures at 2 A resolution[J].J Mol Biol,1989,210(1):163-180.
[9] Jameson B A and Wolf H.The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci,1988,4(1):181-186.
[10] Nicholson K G,Wood J M,Zambon M.Influenza[J].Lancet,2003,362(9397):1733-1745.
[11] Kash J C, Basler C F, García-Sastre A, et al. Global host immune response: pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza viruses expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus[J].J Virol, 2004,78(17):9499-9511.
(收稿日期:2013-03-28) (本文編輯:連勝利)