摘 要：脊椎動物單從體表特征來看，一般呈兩側(cè)對稱，但是大多數(shù)內(nèi)臟器官和系統(tǒng)在體內(nèi)多為不對稱分布，而且這種分布方式對于器官或系統(tǒng)功能的行使是必須的。左右不對稱發(fā)育起始于胚胎時期，打破了機體兩側(cè)對稱的發(fā)育模式，在不同脊椎動物中均很保守。目前利用斑馬魚為模式生物，對胚胎左右不對稱發(fā)育的研究已經(jīng)取得了一系列進展，包括臨時器官Kupffer’s 囊泡的形成、左右不對稱發(fā)育信號在側(cè)板中胚層中的傳遞、器官不對稱分布等。本文就近年來以斑馬魚為模式生物對胚胎左右不對稱發(fā)育機制研究的進展進行綜述。

關(guān)鍵詞：左右不對稱發(fā)育；Kupffer’s 囊泡；側(cè)板中胚層；細胞信號通路；正反饋調(diào)節(jié)

中圖分類號：Q959.46+8.03-1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0135-05

脊椎動物體軸形成主要包括前后軸、背腹軸分化及之后發(fā)生的左右不對稱發(fā)育。其中左右不對稱發(fā)育打破了機體的兩側(cè)對稱發(fā)育，并且在不同脊椎動物中均很保守。脊椎動物僅從體表特征來看，一般呈兩側(cè)對稱，但是大多數(shù)內(nèi)臟器官和系統(tǒng)在體內(nèi)多為不對稱分布，而且這種分布方式對于器官或系統(tǒng)功能的行使是必須的。研究證實，復(fù)雜的表觀遺傳通路、信號通路、離子通路和遺傳分子機制等貫穿脊椎動物左右不對稱發(fā)育全過程。

斑馬魚（Danio rerio）屬于硬骨魚綱、短擔尼魚屬的一種硬骨魚，與其他模式動物相比，具有生長周期短、繁殖能力強、胚胎體外受精且發(fā)育迅速、早期胚胎完全透明等優(yōu)點，加上日趨完善的分子、細胞、基因和胚胎操作技術(shù)，很容易實施正向和反向遺傳研究操作，使其迅速成長為最重要的模式脊椎動物之一。

在斑馬魚胚胎發(fā)育時期，左右不對稱軸的建立包括以下四個階段（圖1）。首先，從胚胎的卵裂時期（0.75 hpf， hours post fertilization）開始打破機體的對稱性發(fā)育，已經(jīng)建立的前后軸和背腹軸分化方面的一些信號轉(zhuǎn)換成左右不對稱發(fā)育信號；其次，在胚胎的體節(jié)形成早期（10 hpf），逐步形成Kupffer’s 囊泡（硬骨魚中的衍生器官，類似于爪蟾中的Spemann’s 組織中心、鳥類哺乳類的Hensen’s 結(jié)），左右不對稱發(fā)育信號傳遞到胚胎的Kupffer’s 囊泡；此后，在胚胎體節(jié)形成時期（12 hpf），胚胎左右不對稱發(fā)育信號在Kupffer’s 囊泡附近或內(nèi)部建立起來，然后從Kupffer’s 囊泡傳遞到胚胎的側(cè)板中胚層；最后，側(cè)板中胚層的左側(cè)和右側(cè)均具有了左右不對稱基因表達區(qū)域，不對稱發(fā)育信號傳遞到器官原基，最終調(diào)控各器官、系統(tǒng)在機體內(nèi)呈不對稱性分布^[2]。研究證實，多條信號通路，包括Notch 信號通路^[3]、FGF信號通路^[4]、Wnt信號通路和BMP信號通路^[5]等，參與調(diào)控Kupffer’s 囊泡的形成、纖毛的形成、左右不對稱信號傳遞、內(nèi)臟器官和系統(tǒng)不對稱性分布等，它們在胚胎發(fā)育的不同時期、不同程度的參與了左右不對稱軸形成過程，相互作用，共同整合調(diào)控早期的左右不對稱發(fā)育^[2]。而關(guān)于斑馬魚左右不對稱發(fā)育的綜述國內(nèi)還未見報道，現(xiàn)對已有研究結(jié)果進行綜述。

1 斑馬魚胚胎左右不對稱發(fā)育的起始

斑馬魚胚胎前后軸發(fā)育起始于4-cell（1 hpf）時期。Nodal是轉(zhuǎn)錄生長因子-β家族（TGF-β）中的一員，研究證實在脊椎動物中，Nodal信號是形成左右不對稱發(fā)育軸所必須的^[3]。當胚胎發(fā)育至1 000-cell（3 hpf）時期，抑制H+/K+-ATPase 活性，將導(dǎo)致Nodal信號通路標志性基因southpaw及其靶基因pitx2、lefty2等在側(cè)板中胚層隨機表達，不對稱信號傳遞出現(xiàn)異常，最終造成器官在體內(nèi)的不對稱性分布出現(xiàn)紊亂。由此可知，胚胎前后軸發(fā)育開始后不久，即開啟左右不對稱發(fā)育。

2 胚胎左右不對稱發(fā)育過程

2.1 左右不對稱發(fā)育器官的形成

對斑馬魚的研究發(fā)現(xiàn)，Kupffer’s 囊泡調(diào)控胚胎的左右不對稱發(fā)育。Kupffer’s 囊泡是暫時存在的器官，于1868年被發(fā)現(xiàn)^[6]。當胚胎發(fā)育到原腸期（5.7 hpf）時，背部前驅(qū)細胞（DFCs）遷移到胚胎外包最前端，在原腸期結(jié)束時（10 hpf）內(nèi)卷進入胚胎內(nèi)部，細胞發(fā)生形變，位置相互調(diào)整，至胚胎發(fā)育至4～6個體節(jié)（12 hpf）時，在尾芽附近靠近胚胎的腹側(cè)形成Kupffer’s 囊泡^{[2，7，8]}。

研究證實，胚胎卵裂時期細胞與卵黃通過胞質(zhì)橋進行信息交流和物質(zhì)傳遞，通常胚胎發(fā)育到64-cell（2 hpf）時期細胞與卵黃之間的胞質(zhì)橋關(guān)閉，但背部前驅(qū)細胞（DFCs）與卵黃的信息交流和物質(zhì)傳遞將持續(xù)到sphere（4 hpf）時期^[7]。利用這一時間差，Amack 和Yost發(fā)明了中囊胚顯微注射技術(shù)^[8]，即中囊胚時期（2.5～2.75 hpf）將帶有熒光標簽的特定morpholino反義寡核苷酸（MO，能特異封閉基因表達）注射進入卵黃（靠近細胞邊緣），這樣MO能特異進入背部前驅(qū)細胞，達到在背部前驅(qū)細胞中特異敲降基因的目的。當胚胎發(fā)育到60%外胞時期，在熒光顯微鏡下對胚胎進行挑揀，將熒光集中在背部前驅(qū)細胞的胚胎挑揀出來進入下一步實驗。通過此方法證明了Kupffer’s 囊泡由背部前驅(qū)細胞發(fā)育而來，并參與左右不對稱發(fā)育調(diào)控^[10]。切除背部前驅(qū)細胞或者Kupffer’s 囊泡，均會造成機體左右不對稱發(fā)育異常，從而證明了Kupffer’s 囊泡是建立左右不對稱軸所必須的^[10]。隨后Yost 等^[11]使用激光技術(shù)破壞胚胎背部前驅(qū)細胞以及定點敲降背部前驅(qū)細胞lrdr1基因等方法進行了更深入的研究，證明了正是短暫存在的Kupffer’s 囊泡，調(diào)控了斑馬魚胚胎早期的左右不對稱發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，不同脊椎動物調(diào)控左右不對稱發(fā)育的器官均是保守的。在對小鼠胚胎進行的研究中，發(fā)現(xiàn)了小鼠node或稱為nodal flow的相關(guān)功能。從腹側(cè)方向看，node 中的單纖毛都朝著順時針方向運動，纖毛的旋轉(zhuǎn)使得nodal flow形成了向左側(cè)的胞外流，進而產(chǎn)生了胚胎左右不對稱發(fā)育的信號，打破了之前胚胎中建立的兩側(cè)對稱^[12]。研究發(fā)現(xiàn)建立小鼠胚胎左右不對稱機制需要行使node 的功能，并且單纖毛的旋轉(zhuǎn)和液體流是建立左右不對稱軸所必須的^[13]。除node 附近細胞外，還有其他多種物質(zhì)途徑參與了調(diào)控，包括與H+/K+-ATPase 活性相關(guān)的鈣離子水平、Notch 信號通路的左右不對稱激活，還有RA信號通路等，都不同程度參與了左右不對稱發(fā)育的調(diào)控^[14]。

研究證實，在除了小鼠以外的其他脊椎動物中，左右不對稱發(fā)育的信號和特征開啟出現(xiàn)在node 形成之前。

2.2 Kupffer’s 囊泡中單纖毛和液體流調(diào)控左右不對稱發(fā)育

斑馬魚Kupffer’s 囊泡單纖毛（典型的9+2微管結(jié)構(gòu)）形成于細胞膜頂端^[10]，轉(zhuǎn)錄因子基因ift57和ift88調(diào)控單纖毛的形成并維持其形態(tài)，敲降ift57或ift88等基因，導(dǎo)致Kupffer’s 囊泡中單纖毛形成異常，缺乏運動能力，液體流發(fā)生紊亂，造成胚胎左右不對稱發(fā)育異常^[15]。Stubbs等^[16]研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路的靶基因——轉(zhuǎn)錄因子基因foxj1a也能主動調(diào)節(jié)運動單纖毛的產(chǎn)生，敲降foxj1a將下調(diào)單纖毛中l(wèi)rdr1和centrin2基因的表達，最終導(dǎo)致Kupffer’s 囊泡液體流紊亂，干擾正常胚胎的不對稱發(fā)育。

研究表明，除了Hedgehog信號通路，其他眾多信號通路如Notch、FGF、Wnt信號通路均可調(diào)節(jié)胚胎的左右不對稱發(fā)育。Notch信號通路 deltaD （aei）突變體^[3]、或敲降FGF信號通路受體基因fgfr1a^[4]、或敲降非經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)節(jié)因子基因duboraya^[17]均會造成背部前驅(qū)細胞中形成單纖毛的組分和運輸因子減少，Kupffer’s 囊泡內(nèi)單纖毛長度變短，左右不對稱發(fā)育異常。說明單纖毛的形成和維持受到Notch、FGF、Hedgehog和 nc-Wnt等信號通路的調(diào)控^{[3，4，16，17]}。

斑馬魚Kupffer’s 囊泡中的單纖毛依賴左右動力蛋白Lrdr1獲得運動能力，單纖毛旋轉(zhuǎn)形成向左側(cè)的液體流，敲降lrdr1基因不影響Kupffer’s 囊泡中單纖毛的形成，但是生成的單纖毛不具備運動能力，無法推動液體流的有序運動，從而導(dǎo)致southpaw等基因在側(cè)板中胚層隨機表達、內(nèi)臟畸形、系統(tǒng)出現(xiàn)畸形等。說明有序的液體流對左右不對稱發(fā)育具有重要意義^[18，19]。

目前仍不清楚液體流是怎樣開啟左右不對稱發(fā)育的信號級聯(lián)，但研究發(fā)現(xiàn)僅在Kupffer’s 囊泡左側(cè)細胞出現(xiàn)高濃度Ca2+，說明Ca2+信號通路很有可能參與了此過程，有待于進一步的實驗證實。

2.3 不對稱信號從Kupffer’s 囊泡向側(cè)板中胚層的轉(zhuǎn)移

斑馬魚中Nodal信號通路的標志性基因southpaw，在胚胎發(fā)育到4～6體節(jié)時，在Kupffer’s囊泡兩側(cè)均有表達；胚胎發(fā)育至10～12體節(jié)時，其表達位置被限制在側(cè)板中胚層的左側(cè)^[21]。southpaw表達受正反饋調(diào)節(jié)方式調(diào)控，但是在側(cè)板中胚層不對稱性表達機制仍然未知^[21]。最近的研究對此提出了以下幾種可能。

單纖毛旋轉(zhuǎn)形成了向左側(cè)的液體流，促使細胞內(nèi)的Ca2+集中在Kupffer’s 囊泡左側(cè)細胞內(nèi)，誘導(dǎo)依賴Ca2+的蛋白激酶Ⅱ（CaMK-Ⅱ）磷酸化，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+和胞外Ca2+向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。Ca2+信號通路的正反饋調(diào)節(jié)可能是southpaw表達位置被限制在側(cè)板中胚層左側(cè)的原因之一^[22]。

Charon屬于Cerberus/Dan家族，也有助于southpaw在側(cè)板中胚層的不對稱性表達。胚胎發(fā)育到6體節(jié)時，charon在Kupffer’s 囊泡兩側(cè)均有表達，受到液體流的影響，當胚胎發(fā)育到8～10體節(jié)時， charon在Kupffer’s 囊泡右側(cè)表達升高，并綁定到Southpaw上，拮抗southpaw在側(cè)板中胚層右側(cè)表達。southpaw受到正反饋調(diào)節(jié)和Charon的抑制作用，使其從兩側(cè)表達轉(zhuǎn)變成僅在側(cè)板中胚層左側(cè)表達^[2，23]。

2.4 不對稱信號在側(cè)板中胚層的表達

研究發(fā)現(xiàn)，敲降斑馬魚Nodal 突變體中的 southpaw基因，導(dǎo)致其靶基因pitx2、lefty2在側(cè)板中胚層隨機表達，lefty1在胚胎中線（脊索）表達缺失或者部分缺失^[22]。這些發(fā)現(xiàn)表明斑馬魚存在保守基因級聯(lián)，由southpaw發(fā)起，激活Nodal信號通路，產(chǎn)生左右不對稱性信號，通過側(cè)板中胚層傳遞到器官原基，開啟胚胎左右不對稱發(fā)育。

Lefty1是Nodal信號通路的抑制因子。胚胎發(fā)育到10～18體節(jié)時，Southpaw和TGF-β家族中的另一成員Bmp激活胚胎中線lefty1基因表達^[24]。正常情況下Southpaw在側(cè)板中胚層左側(cè)表達，當胚胎缺少Lefty1時，Southpaw將越過胚胎中線出現(xiàn)在側(cè)板中胚層右側(cè)，并通過正反饋調(diào)節(jié)，刺激側(cè)板中胚層右側(cè)產(chǎn)生新的Southpaw蛋白，表明lefty1在胚胎中線表達時起柵欄的作用，阻止Southpaw向側(cè)板中胚層右側(cè)擴散^[25]。

在對雞胚的研究中，Tabin 等^[9]在側(cè)板中胚層左側(cè)發(fā)現(xiàn)了Nodal 信號的表達。在雞胚與左右不對稱發(fā)育密切相關(guān)的Hensen’s結(jié)右側(cè)，activin相關(guān)信號的激活將抑制SHH信號表達，使得SHH信號主要在Hensen’s結(jié)左側(cè)表達，從而激活左側(cè)Nodal 信號，抑制右側(cè)Nodal 信號的表達，并且與TGF-β 信號相關(guān)。TGF-β信號可以正向調(diào)控nodal在胚胎側(cè)板中胚層的表達，使其表達區(qū)域很快集在側(cè)板中胚層左側(cè)，而同時nodal的功能和表達又會受到Lefty1和Lefty2 的抑制，這樣就在側(cè)板中胚層形成了nodal表達的反饋調(diào)節(jié)通路^[2]。因此，通常通過檢測胚胎早期Nodal信號通路的標志性基因如southpaw、pitx2等的表達情況來觀察胚胎左右不對稱發(fā)育情況。

2.5 器官的不對稱分布

機體內(nèi)的內(nèi)臟器官和系統(tǒng)如大腦、心臟、肝臟、胰腺、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等都呈不對稱性分布。胚胎左右不對稱發(fā)育信號從側(cè)板中胚層傳遞到器官原基，調(diào)控了器官的位置分布。Southpaw在側(cè)板中胚層左側(cè)的表達信號傳遞到器官原基，確定器官生長位置^[22]。

轉(zhuǎn)基因魚[lefty1∶∶GFP]可以監(jiān)測Nodal的活性，敲降轉(zhuǎn)基因魚 [lefty1∶∶GFP]的southpaw，導(dǎo)致間腦部位的Nodal信號在側(cè)板中胚層左側(cè)的表達量減少，表明southpaw在側(cè)板中胚層左側(cè)的表達可調(diào)控大腦Nodal信號活性。Aizawa等^[26]利用abf突變體進行研究得出，大腦與內(nèi)臟器官如心臟、膽囊等在機體內(nèi)的分布機制不同，abf突變體心臟會出現(xiàn)嚴重的畸形，約50%的胚胎心臟在機體的位置發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在這部分胚胎中，Nodal信號僅在間腦右側(cè)被激活。

心臟的不對稱性分布受到bmp4、lefty2等基因表達的調(diào)控^[3]。胚胎發(fā)育到18～20體節(jié)時，心臟原基最早出現(xiàn)在側(cè)板中胚層的兩側(cè)，后遷移到中線位置融合形成管狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過一系列的環(huán)化過程，即心室向右心房向左，相互之間形成一定角度，心臟形成D-loop形狀^[27]。研究表明這個過程受到Nodal信號通路和BMP信號通路調(diào)控^[2，22]。

腸道的形成也需要經(jīng)歷一系列的環(huán)化過程，依賴不對稱性信號在側(cè)板中胚層的傳遞。在野生型胚胎中，側(cè)板中胚層兩側(cè)信號在動物極和植物極的遷移是獨立進行的，腸道在機體內(nèi)有序分布。敲降胚胎southpaw基因?qū)е聜?cè)板中胚層信號在動物極和植物極隨機遷移，造成腸道分布紊亂^[28]。

前人對器官在機體內(nèi)的分布進行了大量研究工作，但是左右不對稱信號通過側(cè)板中胚層傳遞到器官原基的機制及最終器官位置定位機制至今仍然未知。

3 總結(jié)與展望

使用斑馬魚作為模式生物，研究脊椎動物左右不對稱軸的建立過程，發(fā)現(xiàn)眾多基因和信號通路參與調(diào)控Kupffer’s 囊泡的形成、左右不對稱信號在Kupffer’s 囊泡和側(cè)板中胚層之間的傳遞、器官原基的形成及器官定位等^[29]。雖然目前對斑馬魚左右不對稱發(fā)育有了一定的認識，但是仍然有許多問題沒有解決：（1）胚胎左右不對稱發(fā)育起始在前后軸、背腹軸發(fā)育之后，但是左右不對稱發(fā)育是怎樣打破兩側(cè)對稱發(fā)育的仍未清楚；（2）Kupffer’s 囊泡內(nèi)液體流的有序運動可以激發(fā)不對稱發(fā)育信號級聯(lián)，但是液體流是如何接收左右不對稱發(fā)育信號并向下游傳遞的依然未知。這些問題仍需要進一步的研究。

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