摘 要：根據(jù)多年來玉米單倍體育種研究的理論和實踐，結(jié)合國內(nèi)外單倍體育種的成功經(jīng)驗，組裝集成了“玉米單倍體高效加倍技術(shù)規(guī)范”（僅供參照試用）。本規(guī)范是玉米單倍體人工（化學(xué)）加倍的基本操作程序，適用于利用雜交誘導(dǎo)單倍體快速選育玉米自交系技術(shù)，主要包括單倍體種植、單倍體植株確認(rèn)、高效加倍技術(shù)、單倍體植株的授粉與收獲、獲得DH系等5個技術(shù)環(huán)節(jié)。按此技術(shù)規(guī)程操作，可顯著提高單倍體的加倍率和育種成效。

關(guān)鍵詞：玉米單倍體；標(biāo)記性狀；DH系；化學(xué)加倍；注意事項

中圖分類號： S513.035.2 文獻(xiàn)標(biāo)識號：B 文章編號：1001-4942（2013）10-0121-05

玉米單倍體育種可顯著縮短育種進(jìn)程、提高育種成效，已成功應(yīng)用于國內(nèi)外玉米育種項目，并達(dá)到規(guī)模化應(yīng)用的需求。但是，該方法尚存在一定的制約因素，如單倍體的誘導(dǎo)率和加倍效率不高，此外，不少育種單位利用一代雜交種作選系基礎(chǔ)材料直接誘導(dǎo)單倍體，不能有效打破不良基因的連鎖，基因間的重組幾率較低。因此，單倍體育種必須與種質(zhì)擴(kuò)增、育種材料的改良有機(jī)結(jié)合起來，先對誘導(dǎo)材料進(jìn)行有效的重組改良，累積足夠的有利基因，再進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)，此外，還要研制簡便、易行、高效、規(guī)范的加倍技術(shù)，建立玉米單倍體高效加倍技術(shù)新體系，才能發(fā)揮單倍體育種的技術(shù)優(yōu)勢，提高育種效率，促進(jìn)品種和技術(shù)創(chuàng)新。本文總結(jié)的“玉米單倍體高效加倍技術(shù)規(guī)范”為提高玉米單倍體加倍率和育種成效提供了參考。

1 術(shù)語及定義

1.1 單倍體及單倍體育種

玉米通常具有兩套染色體組，稱作二倍體（Diploid）。其配子只有一套染色體組，只有配子染色體的細(xì)胞或個體稱作單倍體（Haploid）。單倍體可以自然產(chǎn)生，也可通過雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生。目前，玉米單倍體育種普遍采用孤雌生殖誘導(dǎo)系雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，利用特定的標(biāo)記性狀，可在雜交當(dāng)代果穗上挑揀出單倍體籽粒。單倍體只有加倍成二倍體才能恢復(fù)育性，獲得種子。加倍后形成的自交系稱為DH（Doubled Haploid）系，表現(xiàn)整齊一致，可直接用于育種或遺傳研究。這種育種方法國際上稱為單倍體育種（Haploid Breeding）或DH育種技術(shù)。

1.2 標(biāo)記性狀及單倍體的篩選

一般誘導(dǎo)系都帶有籽粒和植株顏色兩套標(biāo)記性狀，表現(xiàn)為紫色的胚乳頂端、胚芽尖；紫色葉片、葉鞘乃至植株。這些標(biāo)記性狀受顯性基因控制，在雜交后代中顯性表達(dá)。優(yōu)良的誘導(dǎo)系，其籽粒標(biāo)記性狀明顯、誘導(dǎo)率高、花粉量大、抗病性好、結(jié)實性好。新改良誘導(dǎo)系的標(biāo)記性狀還有大胚（高油籽粒）、黃綠幼苗等性狀。

單倍體籽粒一般具有紫色粒頂、無色胚芽尖、凹陷三角形胚等性狀，可根據(jù)單倍體籽粒的標(biāo)記性狀逐粒挑選準(zhǔn)單倍體籽粒。另外，單倍體植株田間表現(xiàn)矮小、瘦弱，且生長緩慢，葉片窄小上沖或直立，葉色較淡，偶爾出現(xiàn)白斑。由于僅有一套染色體，單倍體植株生育進(jìn)程緩慢，雌雄花期高度不協(xié)調(diào)，雄穗敗育、不開花，雌穗較正常、可抽絲，一般不能自交結(jié)實。因此，可依據(jù)單倍體的田間表現(xiàn)作進(jìn)一步鑒選。

1.3 DH系

單倍體植株雌穗、雄穗通過自然或人工化學(xué)加倍后，可產(chǎn)生可育卵子、花粉。授粉后所結(jié)籽粒長出的植株稱之為DH系或雙倍體自交系。在遺傳學(xué)意義上，DH系具有二套染色體，基因高度純合；在形態(tài)特征上，DH系性狀高度一致。

1.4 化學(xué)加倍和加倍劑

對自然加倍率很低的單倍體基因型必須進(jìn)行化學(xué)加倍處理才能滿足育種需求。目前，加倍方法多是利用化學(xué)藥劑破壞細(xì)胞有絲分裂的紡錘絲形成，使兩個子細(xì)胞染色體在有絲分裂后期不移向兩極，改變分裂細(xì)胞染色體倍性，實現(xiàn)染色體加倍。

常用的化學(xué)加倍劑是秋水仙素。秋水仙素是從百合科秋水仙屬秋水仙（Colchicum autumnale L.）的種子及器官中提取出來的一種生物堿，其分子式為C22H25NO6，有劇毒，不僅對人體毒性很大，且易造成植物幼苗死亡、畸形等。

二甲基亞礬（DMSO）、吐溫80（Tween-80）和細(xì)胞分裂素是常用的輔助劑。研究發(fā)現(xiàn)，部分細(xì)胞分裂抑制劑，如除草劑甲基胺草磷（APM， Amipro-phosmethyl）、炔苯酰草胺 （拿草特，Pronamide）、二硝基苯胺（氟樂靈，Trifluralin）和安磺靈（Oryzalin）等也具有良好的加倍效果。不同的加倍方法和操作熟練程度其加倍效果差異很大。

2 單倍體高效加倍技術(shù)操作程序

2.1 單倍體種植

2.1.1 選地與播期 不同的生態(tài)環(huán)境和基礎(chǔ)材料，單倍體自然加倍率差異較大。氣候涼爽、晝夜溫差大的環(huán)境有利于單倍體植株的自然加倍；逆境生態(tài)條件（極端高溫、干旱、低溫寡照、瘠薄等）不利于單倍體的自然加倍，但有利于單倍體植株的自然選擇，易獲得抗逆、廣適的DH 系。因此，應(yīng)根據(jù)各地不同情況、不同的育種計劃、不同育種規(guī)模選擇環(huán)境適宜、土壤肥力中等偏上、排灌方便的地塊，適期播種，確保玉米全生育期有良好的生長發(fā)育環(huán)境和肥水保障。實踐表明，我國海南冬季的加倍率明顯高于北方夏季，北方夏季則高于北方春季。

2.1.2 播種與田間管理 單倍體種子發(fā)芽勢、長勢極弱，應(yīng)根據(jù)不同環(huán)境要求，選擇條直播、育苗移栽等單粒精細(xì)播種方法，確保盡可能獲得多的單倍體植株。

2.1.3 播種密度 根據(jù)土壤肥力與施肥水平、種植方式等確定種植密度，提倡大（70～80 cm）、小（30～40 cm）行或起大壟雙行種植，窄行間鋪設(shè)滴灌管，留苗密度8.0萬～12.0萬株/hm2 為宜。

2.1.4 田間管理原則 單倍體苗生長緩慢、發(fā)育弱，加倍過程需要良好的環(huán)境條件。因此，高溫干旱地區(qū)必須配備滴灌設(shè)施，搭建遮陽網(wǎng)（透光率50%～70%），確保足量的肥水供應(yīng)和良好的栽培管理措施，分次追施化肥，適期、適量灌水，嚴(yán)防蟲鼠危害。

2.2 單倍體植株確認(rèn)

由于籽粒標(biāo)記性狀的著色程度受多個修飾基因控制，加之發(fā)育環(huán)境等因素的影響，致使籽粒標(biāo)記性狀表現(xiàn)弱、著色模糊，籽粒鑒定時易造成“誤判”。所以，單倍體籽粒在田間種植后，應(yīng)依據(jù)植株標(biāo)記性狀作進(jìn)一步甄別，確認(rèn)單倍體植株。

一般單倍體幼苗10葉期前后，可依據(jù)植株標(biāo)記性狀及形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒別確認(rèn)， 凡幼苗葉鞘和葉片為紫色、植株粗壯高大者均不是單倍體，應(yīng)予以淘汰。由于標(biāo)記性狀可能發(fā)生自然突變而喪失，因此，還需要根據(jù)幼苗的生長發(fā)育速度、株高、葉片長度、葉色以及葉片夾角等判斷。一般玉米單倍體植株高度是二倍體的70%左右，因此，株高是鑒定單倍體植株最快速的方法之一。植株生長勢介于單倍體植株和雜交植株之間，葉片葉鞘為綠色的是單倍體自然加倍形成的二倍體植株，自交后即可成自交系。葉片葉鞘紫色、植株瘦弱則是來自誘導(dǎo)系的單倍體植株，非選系基礎(chǔ)材料的單倍體植株，應(yīng)剔除。

2.3 高效加倍技術(shù)

自然加倍是單倍體加倍最簡便的方法。但是，不同材料、不同生態(tài)環(huán)境和種植時間，單倍體的自然加倍率存在顯著差異。有的材料自然加倍率可達(dá)10%，而有的材料幾乎不發(fā)生自然加倍。自然加倍率高的材料，依靠育性的自然恢復(fù)可以實現(xiàn)自交結(jié)實，而自然加倍率很低的材料只有通過人工（化學(xué)）加倍才能提高加倍率。

常用的化學(xué)加倍方法主要有：浸種法、浸根法、浸芽法、注射法等。不同單位、不同時間、不同地點、不同方法、不同熟練程度等獲得的加倍效果差異很大，重復(fù)性較差。有的跨國公司已經(jīng)研制出培養(yǎng)基法、浸根法等專利技術(shù)，并規(guī)模化應(yīng)用。

2.3.1 浸種法 浸種法即用秋水仙素溶液浸泡萌動的單倍體種子。先將單倍體種子用清水浸泡20～24 h，種子吸脹后，用秋水仙素溶液（0.06%秋水仙素+2%DMSO）浸泡12～16 h，再用清水浸泡1～2 h后播種，以減少對種子的毒害，同時也避免播種時對人體的毒害。這種方法的單倍體加倍率可達(dá)10%～20%。

2.3.2 浸芽法 浸（切）芽法即用秋水仙素溶液浸泡幼芽的方法。當(dāng)單倍體籽粒發(fā)芽到2 cm左右時，用刀片削掉幼芽頂端以露出一個小口（但不要傷害到嫩芽），然后在秋水仙素溶液（0.06%秋水仙素+2%DMSO）中浸泡8～12 h，浸泡后的幼芽在清水中沖洗0.5 h后移栽到育苗盤中，溫室培養(yǎng)，當(dāng)幼苗長到4～5片葉時移栽到大田。這種方法的加倍率可達(dá)20%～30%。國外依托此法，已研制出從芽苗加倍到機(jī)械化移栽的規(guī)模化育種程序。

2.3.3 浸根法 浸根法即用秋水仙素溶液浸泡單倍體幼苗根。將3葉期單倍體幼苗的根系在0.05% 或0.15% 的秋水仙素溶液中分別浸泡24 h 或3 h，清水沖洗處理后，移栽于生長發(fā)育條件良好的環(huán)境下。該方法加倍效果比較好，雄花可育率達(dá)到30%～60%，但所需藥劑量較大，成本較高。

2.3.4 注射法 注射法多在精密試驗時采用。在6～7葉期用注射器在植株莖尖生長點處注射0.1 ml秋水仙素溶液（0.4%～0.6%秋水仙素+2.0%DMSO）。這種方法加倍率可達(dá)10%～20%，優(yōu)點是不需要育苗和移栽，缺點在于處理過程較費工，處理時期以及注射部位的選擇難以把握從而影響加倍的效果，且隨著秋水仙素濃度的提高，植株受藥害的比例增加。

2.3.5 除草劑加倍法 秋水仙素不僅毒性大，而且使用不當(dāng)易造成死苗、畸形等情況。利用一些具有類似功能的細(xì)胞分裂抑制劑，如APM、拿草特、氟樂靈和安磺靈等除草劑，在單倍體苗5～7葉期對苗噴灑具有良好的加倍效果。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)已研制出“利用除草劑加倍玉米單倍體的方法及專用除草劑”專利技術(shù)（專利號：201110325133）。該方法安全、簡便、易操作，是大規(guī)模加倍的有效方法之一。

據(jù)惠國強(qiáng)等研究報道，用1%肥皂水+0.1%吐溫80，把APM（純度98%）、拿草特和氟樂靈原液分別配成20、40、80和160 μmol/L的溶液，對3～5葉期單倍體幼苗進(jìn)行滴心處理，每株約1 ml。結(jié)果表明，3種除草劑對玉米單倍體均有加倍效果，加倍率為3.42%～26.32%。其中80 μmol/L的APM加倍效果最佳，使用80 μmol/L的APM處理8607×8609、先玉335和中農(nóng)大4號3個雜交種的單倍體，加倍率分別為14.99%、25.02%和20.13%。方差分析表明，3個基因型間單倍體加倍率呈極顯著差異，可見不同基因型的單倍體對除草劑的敏感性存在差異。

2.4 單倍體植株的授粉與收獲

2.4.1 單倍體植株的選擇 一般單倍體植株都矮小瘦弱，只有長勢健壯的單倍體植株才有可能自交結(jié)實，因此，單倍體植株的選擇要堅持擇優(yōu)選擇（Preferential selection）原則。

2.4.2 單倍體植株的授粉 單倍體植株的授粉與常規(guī)授粉方法基本相同，但需仔細(xì)觀察、精細(xì)操作。每天兩次檢查單倍體雄穗，一般在早上8∶00～9∶00和下午16∶00～17∶00，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有花藥外露，并有明顯花粉產(chǎn)生時，小心取其花藥，破開取其花粉，進(jìn)行精細(xì)自交授粉，次日有花粉時，再補(bǔ)充授粉一次。授粉后嚴(yán)格封閉好套雌穗的袋，避免外來花粉污染與蟲媒花粉傳染。

2.4.3 DH籽粒的收獲、保存 單倍體自交果穗上所結(jié)籽粒即為DH籽粒。自交果穗成熟后或授粉后35 d左右即可收獲。一般單倍體自交果穗結(jié)粒少，脫水很快，如果不及時收獲，籽粒就會腐爛或粒頂開裂，喪失出苗能力，所以應(yīng)及時收獲，避免自交粒霉變或脫落。單穗分裝編號，待干燥后仔細(xì)脫粒，妥善保管，避免混雜。

2.5 獲得DH系

2.5.1 DH籽粒的播種 獲得的DH果穗脫粒后種成穗行，仔細(xì)精密播種，確保正常出苗，注意肥水管理，勿受病蟲危害。由于DH籽粒遺傳上高度純合，活力和長勢弱，遇到不良環(huán)境易造成不發(fā)芽或缺苗斷壟，因此，環(huán)境條件差的地塊宜采用育苗移栽的方式保證出苗。

2.5.2 DH植株的鑒定 同一穗行的植株長勢整齊一致，性狀無分離，且不是雜交種株型，可確認(rèn)為純合的DH系。有的穗行植株間性狀有分離，或帶有誘導(dǎo)系標(biāo)記性狀，為雜合花粉污染的結(jié)果或DH 系里含有誘導(dǎo)系的DNA 污染所致，需及時淘汰。

2.5.3 DH系的繁殖 將確認(rèn)為純合自交系的DH植株嚴(yán)格自交授粉，獲得自交籽粒，第2年通過常規(guī)鑒定程序，鑒選出表現(xiàn)優(yōu)異的DH系，第3 年即可作為新自交系進(jìn)行配合力測定，用于雜交組合配制或遺傳研究等。

3 注意事項

由于化學(xué)加倍過程中需要用到秋水仙素，秋水仙素為劇毒藥品，因此，要高度注意安全，重點注意以下方面：

3.1 謹(jǐn)慎操作

所有在加倍過程中接觸到秋水仙素的儀器都要專門存放、隔離，避免其他人接觸。秋水仙素溶液的配制、試驗材料浸泡和沖洗盡量都在通風(fēng)櫥里進(jìn)行。種子和苗浸泡后一定要用清水沖洗，再進(jìn)行下一步的操作，操作時一定要戴上口罩和手套。3M全面罩呼吸保護(hù)器佩戴時，一定要拉緊，并進(jìn)行正壓和負(fù)壓密合性試驗。

3.2 秋水仙素廢液處理方法

秋水仙素是環(huán)境致癌物質(zhì)，處理后的秋水仙素廢液不能隨意排放到環(huán)境中，而應(yīng)集中處理確認(rèn)失效之后才能排放。秋水仙素易吸收空氣中的水分和二氧化碳生成次氯酸而失效，因此，使用后的秋水仙素廢液可用大量的水進(jìn)行稀釋，盛放1年后即可失效；也可用熱堿進(jìn)行處理，使之降解失效。

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