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        玉米白化突變體As—81647的鑒定及基因定位

        2013-12-31 00:00:00鐘世宜等
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年10期

        摘 要:白化突變體As-81647是在自交系81647的自交后代中發(fā)現(xiàn)的自然突變體。光合色素含量測(cè)定表明,白化突變體葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量分別為正常植株的0.6%、5.8%和1.6%,推測(cè)光合色素含量的減少導(dǎo)致突變體光合作用強(qiáng)度減弱,無(wú)法利用光能進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),進(jìn)而造成突變體產(chǎn)生白化表型,三葉期左右萎蔫死亡。組織細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)H2O2的積累可能是造成突變體細(xì)胞死亡的直接原因之一。本研究構(gòu)建了As-81647雜合突變體與蒙自2的雜交F2分離群體,遺傳分析表明該白化性狀由一對(duì)隱性核基因控制,暫時(shí)命名為As-81647(Albino seeding-81647)。利用已公布的SSR分子標(biāo)記和本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記,將該基因定位在玉米第3染色體umc1052和umc1641之間,遺傳距離分別為0.7 cM和 2.8 cM 且與分子標(biāo)記as47共分離。

        關(guān)鍵詞:玉米(Zea mays L.);白化突變體;基因定位

        中圖分類(lèi)號(hào):S513.032 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2013)10-0012-04

        高等植物中,植株葉色突變比較常見(jiàn),該類(lèi)突變體是研究植物光合作用、光形態(tài)建成等的理想材料[1~6]。此外,葉色突變極易識(shí)別,可作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于良種選育[7]和雜交育種[8]中。Gustafsson根據(jù)突變體苗期的葉色差異將葉色突變分為白化、黃化、淡綠、條紋和斑點(diǎn)五種類(lèi)型[9]。其中,白化致死突變是葉綠素缺失突變體中缺失最徹底、最嚴(yán)重的一類(lèi),這種極端表型的突變體在機(jī)理研究方面具有更為重要的利用價(jià)值。目前在擬南芥[10]、玉米[11]、水稻[12,13]、煙草[14]等植物中均有白化突變體的報(bào)道。玉米突變體庫(kù)MaizeGDB報(bào)道的177個(gè)葉色突變基因中,白化基因16個(gè),黃白葉基因12個(gè),這些基因的研究進(jìn)展不一致,有些已定位到很小的區(qū)域,有些只初步定位到特定染色體上。16個(gè)白化基因及染色體定位結(jié)果為:w*-018-3(1)、w*-021-7(5)、w*-062-3(3)、w*-6577(1.06)、w*-8345(1.05)、w*-8889(9.03)、w*-8950(9)、w*-8954(6)、w*-9000(9.01)、w*-9005(4)、w20 white(1.05)、w24 white(1.06)、ij1 iojap striping1(7.03)、blh*-N2359(8.04)和blh*-N487C(1); 12個(gè)黃白葉基因及染色體定位結(jié)果為:yg*-N2448(1.02)、v*-N308(5.05)、wl*-N1803(9)、wl*-N1982(8.05)、wl*-N311B(4.06)、wl*-N362B(6.02)、wl*-N4(3.05)、wl*-N44(5)、wl*-N47(1.06)、wl*-N56(1.06)、wl*-N60(1.06)、wlu7(1.05)和wlu9(5.05)。

        本研究從玉米自交系81647中發(fā)現(xiàn)了白化突變體As-81647,此突變體從出苗到二葉或三葉期萎蔫死亡期間所有葉片均是白色,與我們之前報(bào)道的來(lái)源相同的黃化致死突變體nec-t[15]表型明顯不同。本研究的主要目的是初步明確白化基因As-81647的遺傳特點(diǎn),確定其在染色體上的位置,為進(jìn)一步研究白化突變體形成的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        本實(shí)驗(yàn)室選育的含白化突變基因的自交系81647(As-81647雜合突變體)和正常自交系蒙自2。

        1.2 光合色素提取及含量的測(cè)定

        1.2.1 光合色素的提取 利用95%乙醇離體法萃取二至三葉期玉米葉片光合色素[16]。

        1.2.2 光合色素含量的測(cè)定 利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2450分別測(cè)量提取液在波長(zhǎng)665、649 nm和470 nm 下的吸光度。根據(jù)Lichtenthaler修正公式[17]計(jì)算各光合色素的含量。

        1.3 組織細(xì)胞染色

        1.3.1 臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue)染色 將植株葉片浸泡在臺(tái)盼藍(lán)溶液中(每1 ml乳酚中溶解2.5 mg 臺(tái)盼藍(lán)粉末),沸水浴染色10 min,室溫染色12 h,水合氯醛(2.5 g/ml)中脫色3~4 d 。解剖鏡(Olympus, SZX12)下觀察、照相。

        1.3.2 二氨基聯(lián)苯胺(Diamino benzidine, DAB)染色 將DAB溶于蒸餾水中,使終濃度為1 mg/ml,鹽酸調(diào)pH至3.8。剪取長(zhǎng)度為5 cm 的葉片,浸透于DAB溶液中,光照培養(yǎng)箱反應(yīng)8 h。剪取中間3 cm 置于75%酒精中煮沸,脫色。解剖鏡(Olympus, SZX12)下觀察、照相。

        1.4 遺傳分離群體的構(gòu)建

        利用AS-81647雜合突變體作父本與蒙自2配置雜交組合,用自交能分離出白化突變體的對(duì)應(yīng)單株進(jìn)行F1自交,獲得F2分離群體,用于玉米白化性狀的遺傳分析和白化基因定位。

        1.5 基因組DNA提取與基因定位

        1.5.1 基因組DNA提取 將獲得的F2群體種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗(yàn)站,于二葉期選取幼嫩葉片,采用SDS法提取基因組DNA[18]。

        1.5.2 白化基因As-81647的連鎖分析 采用BSA法篩選與突變基因連鎖的分子標(biāo)記[19],所用PCR反應(yīng)體系(10 μl)為: 10×Easy Taq Buffer(+Mg2+)1.0 μl、dNTPs(2.5 mmol/L )0.2 μl、引物(10 μmol/L ) 1.0 μl、模板DNA(20~50 ng/μl) 1.0 μl、Taq酶(5 U/μl )0.1 μl、ddH2O 6.7 μl。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 45 s,57℃ 30 s,72℃ 50 s,36個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。利用獲得的多態(tài)性分子標(biāo)記鑒定F2代植株并記錄單株表型(白化或正常)。采用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離,使用MapDraw軟件繪制連鎖圖譜。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 白化突變體As-81647的發(fā)現(xiàn)和表型特征

        在玉米自交系81647中發(fā)現(xiàn)葉色白化突變體As-81647,培養(yǎng)箱或大田種植,突變體幼苗都表現(xiàn)為白色,二葉或三葉期萎蔫死亡,整個(gè)生長(zhǎng)期間除所有葉片表現(xiàn)為白色外,其他表型特征與正常植株無(wú)明顯區(qū)別(圖1)。由于純合突變體無(wú)法進(jìn)行生殖生長(zhǎng),該突變性狀依靠雜合體遺傳給后代。

        2.2 白化突變株與正常植株光合色素含量差異

        白化突變植株葉片光合色素含量均顯著低于正常植株(表1),推測(cè)光合色素的缺失可能是導(dǎo)致突變體呈現(xiàn)白化性狀的直接原因。一方面,突變體葉綠素含量極少,葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量分別為正常植株的0.6%、5.8%和1.6%,幾乎不能利用光能進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),只能依靠胚乳提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),待胚乳養(yǎng)分消耗殆盡,突變體隨之死亡,突變體胚乳大小可能決定其萎蔫死亡的早晚;另一方面,突變體葉綠素a/b約為正常植株的1/10,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常水平,葉綠素a/b的值反映了植物的光能利用率,說(shuō)明突變體的光能利用率也低于正常水平。

        2.3 正常植株及突變體葉片的組織細(xì)胞染色

        為進(jìn)一步明確白化突變體死亡的原因,對(duì)突變體和正常植株葉片(三葉期)進(jìn)行了組織細(xì)胞染色。

        2.3.1 臺(tái)盼藍(lán)染色 植物細(xì)胞損傷或死亡時(shí),細(xì)胞膜通透性增強(qiáng),臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜,與解體的DNA 結(jié)合,使其著色;而正常的活細(xì)胞,胞膜結(jié)構(gòu)完整,能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞,從而不會(huì)被臺(tái)盼藍(lán)染色,根據(jù)顏色差異可直接區(qū)分正常與死亡細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果如圖2所示,白化突變體葉片被染成深藍(lán)色,整個(gè)葉片染色較均勻,而正常植株未被染成藍(lán)色,表明該時(shí)期突變體葉片內(nèi)部細(xì)胞已經(jīng)死亡或在死亡進(jìn)程中。

        2.3.2 DAB染色 植物體可通過(guò)葉綠體、線(xiàn)粒體、過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器產(chǎn)生活性氧?;钚匝蹙哂休^高化學(xué)毒性,低濃度活性氧能夠引起植物防御,高濃度活性氧則能夠造成植物細(xì)胞死亡。正常植株通過(guò)一系列代謝清除機(jī)制能夠?qū)⒒钚匝鯘舛染S持在正常水平,若代謝發(fā)生障礙則會(huì)造成活性氧的積累,從而造成植物體細(xì)胞損傷。DAB能與H2O2在過(guò)氧化物酶的催化作用下反應(yīng)生成褐色沉淀物,可用于檢測(cè)H2O2的產(chǎn)生及積累部位。DAB染色結(jié)果如圖3所示,正常植株未見(jiàn)褐色沉淀,而白化突變體的整個(gè)葉片被染成褐色,說(shuō)明白化突變體細(xì)胞死亡過(guò)程中整個(gè)葉片均有H2O2的積累。H2O2的積累可能是導(dǎo)致白化突變體細(xì)胞死亡的直接原因之一。

        2.4 白化突變體遺傳分析

        為探討該白化性狀的遺傳方式,將蒙自2與As-81647雜合突變體雜交,所得F1代植株葉片顏色均表現(xiàn)為綠色。F1自交得到F2,首先鑒定出F2中分離的果穗,從出現(xiàn)分離的果穗中挑選5個(gè)在大田種植鑒定其分離比(表2),卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明正常植株與白化植株呈現(xiàn)3∶1的分離比例,表明該白化突變表型受一對(duì)隱性核基因控制,暫命名為As-81647。

        2.5 白化基因As-81647的定位

        從玉米數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.maizegdb.org)挑選308對(duì)均勻分布在玉米10條染色體上的SSR引物,在兩親本間共檢測(cè)到76對(duì)多態(tài)性標(biāo)記。利用BSA法構(gòu)建正?;虺睾桶谆蛔兓虺剡M(jìn)一步篩選,得到10個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。連鎖分析表明位于第3條染色體上的SSR標(biāo)記umc1594(bin3.09)可能與目的基因連鎖。利用496株F2代白化突變株驗(yàn)證,共出現(xiàn)84株交換單株,進(jìn)一步證明umc1594(bin3.09)與目的基因是連鎖的,遺傳距離為16.9 cM 。利用SSRHunter、Primer Premier5.0軟件在bin3.09區(qū)域開(kāi)發(fā)出54對(duì)SSR標(biāo)記,加上bin3.09區(qū)域25對(duì)公共SSR標(biāo)記,對(duì)分離群體進(jìn)行了連鎖分析,最終將目標(biāo)基因定位于umc1052和umc1641之間,遺傳距離分別為0.7 cM 和2.8 cM ,且與as47共分離(as47所在BAC文庫(kù)為AC212477.3,引物序列:正:AACCCCATCTTGCTCGTA,反:TCGCCATTCTGTAAAGTCC)。利用MapDraw軟件繪制連鎖圖(圖4)。

        3 討論

        白化突變體As-81647與黃化類(lèi)病變突變體nec-t都屬于自然葉色突變,遺傳分析表明兩突變都是受一對(duì)隱性核基因控制,開(kāi)始我們認(rèn)為As-81647是nec-t突變的一種類(lèi)型,通過(guò)進(jìn)一步研究將As-81647定位在bin3.09區(qū)域,與nec-t突變基因定位區(qū)間明顯不同,證明兩突變基因并非等位基因。由于自然界中葉色突變時(shí)有發(fā)生,推測(cè)兩基因在突變進(jìn)程上可能并無(wú)太大關(guān)聯(lián),只是同宗親本在不同方向上的突變。

        MaizeGDB報(bào)道的28個(gè)表型相同或相近的突變基因均與白化基因As-81647處于不同位點(diǎn)且多數(shù)定位范圍較籠統(tǒng)。其中,黃白葉突變基因wl*-N4定位在bin3.05區(qū)域,與As-81647定位區(qū)間不同,兩突變體表型也略有差異,推斷兩突變基因?yàn)榉堑任换颍话谆蛔兓騱*-062-3雖與As-81647定位在相同染色體上,但w*-062-3目前研究較少,無(wú)具體定位區(qū)間的報(bào)道,難以證明與As-81647基因是否等位,為判斷As-81647是否是新的突變基因需要與w*-062-3進(jìn)行進(jìn)一步的等位性分析。此外,As-81647基因定位區(qū)間內(nèi)尚有共分離的SSR標(biāo)記,有待于進(jìn)一步擴(kuò)大群體縮小定位區(qū)間,并進(jìn)一步克隆該基因,為探討葉綠素合成過(guò)程及白化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

        參 考 文 獻(xiàn):

        [1] Fambrini M, Castagna A, Vecchia F D, et al. Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower(Helianthus annuus L.) with abnormal chloroplast biogenesis, reduced PSⅡ activity and low endogenous level of abscisic acid[J]. Plant Science, 2004, 167(1): 79-89.

        [2] Jung K H, Hur J, Ryu C H, et al. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system[J]. Plant and Cell Physiology, 2003, 44(5): 463-472.

        [3] Chen G, Bi Y R, Li N. EGY1 encodes a membrane-associated and ATP-independent metalloprotease that is required for chloroplast development [J]. The Plant Journal, 2005, 41(3): 364-375.

        [4] 呂典華, 宗學(xué)鳳, 王三根, 等. 兩個(gè)水稻葉色突變體的光合特性研究[J]. 作物學(xué)報(bào), 2009, 35(12):2304-2308.

        [5] Damaraju S, Schlede S, Eckhardt U, et al. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants [J]. Journal of Plant Physiology, 2011, 168(12): 1444-1451.

        [6] Agrawal G K, Yamazaki M,Kobayashi M, et al.Screening of the rice viviparous mutants generated by endogenous retrotransposon Tosl7 insertion. Tagging of a zeaxanthin epoxidase gene and a novel osTATC gene[J]. Plant Physiology, 2001, 125(3): 1248-1257.

        [7] 馬志虎, 顏素芳, 羅秀龍, 等. 辣椒黃綠苗突變體對(duì)良種繁育及純度鑒定作用[J]. 北方園藝, 2001, 138(3):13-14.

        [8] 李小林, 鄧安鳳, 徐雨然, 等. 水稻葉緣白化葉色標(biāo)記三系不育系云豐88A的選育[J]. 種子, 2011, 30(12):109-111.

        [9] Gustafsson A. The plastid development in various types of chlorophyll mutations [J]. Hereditas, 1942, 28(3-4): 483-492.

        [10]王曉萌. 擬南芥白化突變體ems15的篩選和基因定位[D]. 上海: 上海師范大學(xué), 2009.

        [11]Han C D, Patrie W, Polacco M, et al. Aberrations in plastid transcripts and deficiency of plastid DNA in striped and albino mutants in maize[J]. Planta, 1993, 191(4): 552-563.

        [12]余慶波, 江 華, 米華玲, 等. 水稻白化突變體alb21生理特性和基因定位[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 34(1):70-75.

        [13]鄭 靜. 一份水稻白化突變體的遺傳分析及其基因定位[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

        [14]徐增漢, 何明雄, 陳登科, 等. 南丹白化煙葉研究初報(bào)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(33):14609-14611,14695.

        [15]韓 帥, 王麗靜, 鐘世宜, 等. 一個(gè)新的玉米葉色突變體的遺傳分析及基因定位[J]. 玉米科學(xué), 2012, 20(3):26-28.

        [16]趙世杰, 史國(guó)安, 董新純, 等. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2002:51-57.

        [17]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京:高等教育出版社, 2001:134-137.

        [18]王憲澤, 王保莉, 馮 炘, 等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003:152-154.

        [19]Michlmore R W, Papan I, Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of Sciences of United States of America, 1991, 88(21): 9828-9832.

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