摘 要：白化突變體As-81647是在自交系81647的自交后代中發(fā)現(xiàn)的自然突變體。光合色素含量測定表明，白化突變體葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量分別為正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，推測光合色素含量的減少導(dǎo)致突變體光合作用強(qiáng)度減弱，無法利用光能進(jìn)行營養(yǎng)生長，進(jìn)而造成突變體產(chǎn)生白化表型，三葉期左右萎蔫死亡。組織細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)H2O2的積累可能是造成突變體細(xì)胞死亡的直接原因之一。本研究構(gòu)建了As-81647雜合突變體與蒙自2的雜交F2分離群體，遺傳分析表明該白化性狀由一對隱性核基因控制，暫時命名為As-81647（Albino seeding-81647）。利用已公布的SSR分子標(biāo)記和本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的分子標(biāo)記，將該基因定位在玉米第3染色體umc1052和umc1641之間，遺傳距離分別為0.7 cM和 2.8 cM 且與分子標(biāo)記as47共分離。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）；白化突變體；基因定位

中圖分類號：S513.032 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0012-04

高等植物中，植株葉色突變比較常見，該類突變體是研究植物光合作用、光形態(tài)建成等的理想材料^[1～6]。此外，葉色突變極易識別，可作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于良種選育^[7]和雜交育種^[8]中。Gustafsson根據(jù)突變體苗期的葉色差異將葉色突變分為白化、黃化、淡綠、條紋和斑點(diǎn)五種類型^[9]。其中，白化致死突變是葉綠素缺失突變體中缺失最徹底、最嚴(yán)重的一類，這種極端表型的突變體在機(jī)理研究方面具有更為重要的利用價值。目前在擬南芥^[10]、玉米^[11]、水稻^[12，13]、煙草^[14]等植物中均有白化突變體的報道。玉米突變體庫MaizeGDB報道的177個葉色突變基因中，白化基因16個，黃白葉基因12個，這些基因的研究進(jìn)展不一致，有些已定位到很小的區(qū)域，有些只初步定位到特定染色體上。16個白化基因及染色體定位結(jié)果為：w*-018-3（1）、w*-021-7（5）、w*-062-3（3）、w*-6577（1.06）、w*-8345（1.05）、w*-8889（9.03）、w*-8950（9）、w*-8954（6）、w*-9000（9.01）、w*-9005（4）、w20 white（1.05）、w24 white（1.06）、ij1 iojap striping1（7.03）、blh*-N2359（8.04）和blh*-N487C（1）； 12個黃白葉基因及染色體定位結(jié)果為：yg*-N2448（1.02）、v*-N308（5.05）、wl*-N1803（9）、wl*-N1982（8.05）、wl*-N311B（4.06）、wl*-N362B（6.02）、wl*-N4（3.05）、wl*-N44（5）、wl*-N47（1.06）、wl*-N56（1.06）、wl*-N60（1.06）、wlu7（1.05）和wlu9（5.05）。

本研究從玉米自交系81647中發(fā)現(xiàn)了白化突變體As-81647，此突變體從出苗到二葉或三葉期萎蔫死亡期間所有葉片均是白色，與我們之前報道的來源相同的黃化致死突變體nec-t^[15]表型明顯不同。本研究的主要目的是初步明確白化基因As-81647的遺傳特點(diǎn)，確定其在染色體上的位置，為進(jìn)一步研究白化突變體形成的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)室選育的含白化突變基因的自交系81647（As-81647雜合突變體）和正常自交系蒙自2。

1.2 光合色素提取及含量的測定

1.2.1 光合色素的提取 利用95%乙醇離體法萃取二至三葉期玉米葉片光合色素^[16]。

1.2.2 光合色素含量的測定 利用紫外可見分光光度計UV-2450分別測量提取液在波長665、649 nm和470 nm 下的吸光度。根據(jù)Lichtenthaler修正公式^[17]計算各光合色素的含量。

1.3 組織細(xì)胞染色

1.3.1 臺盼藍(lán)（Trypan blue）染色 將植株葉片浸泡在臺盼藍(lán)溶液中（每1 ml乳酚中溶解2.5 mg 臺盼藍(lán)粉末），沸水浴染色10 min，室溫染色12 h，水合氯醛（2.5 g/ml）中脫色3～4 d 。解剖鏡（Olympus， SZX12）下觀察、照相。

1.3.2 二氨基聯(lián)苯胺（Diamino benzidine， DAB）染色 將DAB溶于蒸餾水中，使終濃度為1 mg/ml，鹽酸調(diào)pH至3.8。剪取長度為5 cm 的葉片，浸透于DAB溶液中，光照培養(yǎng)箱反應(yīng)8 h。剪取中間3 cm 置于75%酒精中煮沸，脫色。解剖鏡（Olympus， SZX12）下觀察、照相。

1.4 遺傳分離群體的構(gòu)建

利用AS-81647雜合突變體作父本與蒙自2配置雜交組合，用自交能分離出白化突變體的對應(yīng)單株進(jìn)行F1自交，獲得F2分離群體，用于玉米白化性狀的遺傳分析和白化基因定位。

1.5 基因組DNA提取與基因定位

1.5.1 基因組DNA提取 將獲得的F2群體種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗(yàn)站，于二葉期選取幼嫩葉片，采用SDS法提取基因組DNA^[18]。

1.5.2 白化基因As-81647的連鎖分析 采用BSA法篩選與突變基因連鎖的分子標(biāo)記^[19]，所用PCR反應(yīng)體系（10 μl）為： 10×Easy Taq Buffer（+Mg2+）1.0 μl、dNTPs（2.5 mmol/L ）0.2 μl、引物（10 μmol/L ） 1.0 μl、模板DNA（20～50 ng/μl） 1.0 μl、Taq酶（5 U/μl ）0.1 μl、ddH2O 6.7 μl。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 50 s，36個循環(huán)；72℃ 10 min。利用獲得的多態(tài)性分子標(biāo)記鑒定F2代植株并記錄單株表型（白化或正常）。采用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離，使用MapDraw軟件繪制連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 白化突變體As-81647的發(fā)現(xiàn)和表型特征

在玉米自交系81647中發(fā)現(xiàn)葉色白化突變體As-81647，培養(yǎng)箱或大田種植，突變體幼苗都表現(xiàn)為白色，二葉或三葉期萎蔫死亡，整個生長期間除所有葉片表現(xiàn)為白色外，其他表型特征與正常植株無明顯區(qū)別（圖1）。由于純合突變體無法進(jìn)行生殖生長，該突變性狀依靠雜合體遺傳給后代。

2.2 白化突變株與正常植株光合色素含量差異

白化突變植株葉片光合色素含量均顯著低于正常植株（表1），推測光合色素的缺失可能是導(dǎo)致突變體呈現(xiàn)白化性狀的直接原因。一方面，突變體葉綠素含量極少，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量分別為正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，幾乎不能利用光能進(jìn)行營養(yǎng)生長，只能依靠胚乳提供的營養(yǎng)物質(zhì)，待胚乳養(yǎng)分消耗殆盡，突變體隨之死亡，突變體胚乳大小可能決定其萎蔫死亡的早晚；另一方面，突變體葉綠素a/b約為正常植株的1/10，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常水平，葉綠素a/b的值反映了植物的光能利用率，說明突變體的光能利用率也低于正常水平。

2.3 正常植株及突變體葉片的組織細(xì)胞染色

為進(jìn)一步明確白化突變體死亡的原因，對突變體和正常植株葉片（三葉期）進(jìn)行了組織細(xì)胞染色。

2.3.1 臺盼藍(lán)染色 植物細(xì)胞損傷或死亡時，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，臺盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，使其著色；而正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞，從而不會被臺盼藍(lán)染色，根據(jù)顏色差異可直接區(qū)分正常與死亡細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色結(jié)果如圖2所示，白化突變體葉片被染成深藍(lán)色，整個葉片染色較均勻，而正常植株未被染成藍(lán)色，表明該時期突變體葉片內(nèi)部細(xì)胞已經(jīng)死亡或在死亡進(jìn)程中。

2.3.2 DAB染色 植物體可通過葉綠體、線粒體、過氧化物酶體等細(xì)胞器產(chǎn)生活性氧。活性氧具有較高化學(xué)毒性，低濃度活性氧能夠引起植物防御，高濃度活性氧則能夠造成植物細(xì)胞死亡。正常植株通過一系列代謝清除機(jī)制能夠?qū)⒒钚匝鯘舛染S持在正常水平，若代謝發(fā)生障礙則會造成活性氧的積累，從而造成植物體細(xì)胞損傷。DAB能與H2O2在過氧化物酶的催化作用下反應(yīng)生成褐色沉淀物，可用于檢測H2O2的產(chǎn)生及積累部位。DAB染色結(jié)果如圖3所示，正常植株未見褐色沉淀，而白化突變體的整個葉片被染成褐色，說明白化突變體細(xì)胞死亡過程中整個葉片均有H2O2的積累。H2O2的積累可能是導(dǎo)致白化突變體細(xì)胞死亡的直接原因之一。

2.4 白化突變體遺傳分析

為探討該白化性狀的遺傳方式，將蒙自2與As-81647雜合突變體雜交，所得F1代植株葉片顏色均表現(xiàn)為綠色。F1自交得到F2，首先鑒定出F2中分離的果穗，從出現(xiàn)分離的果穗中挑選5個在大田種植鑒定其分離比（表2），卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明正常植株與白化植株呈現(xiàn)3∶1的分離比例，表明該白化突變表型受一對隱性核基因控制，暫命名為As-81647。

2.5 白化基因As-81647的定位

從玉米數(shù)據(jù)庫中（http：//www.maizegdb.org）挑選308對均勻分布在玉米10條染色體上的SSR引物，在兩親本間共檢測到76對多態(tài)性標(biāo)記。利用BSA法構(gòu)建正?；虺睾桶谆蛔兓虺剡M(jìn)一步篩選，得到10個多態(tài)性標(biāo)記。連鎖分析表明位于第3條染色體上的SSR標(biāo)記umc1594（bin3.09）可能與目的基因連鎖。利用496株F2代白化突變株驗(yàn)證，共出現(xiàn)84株交換單株，進(jìn)一步證明umc1594（bin3.09）與目的基因是連鎖的，遺傳距離為16.9 cM 。利用SSRHunter、Primer Premier5.0軟件在bin3.09區(qū)域開發(fā)出54對SSR標(biāo)記，加上bin3.09區(qū)域25對公共SSR標(biāo)記，對分離群體進(jìn)行了連鎖分析，最終將目標(biāo)基因定位于umc1052和umc1641之間，遺傳距離分別為0.7 cM 和2.8 cM ，且與as47共分離（as47所在BAC文庫為AC212477.3，引物序列：正：AACCCCATCTTGCTCGTA，反：TCGCCATTCTGTAAAGTCC）。利用MapDraw軟件繪制連鎖圖（圖4）。

3 討論

白化突變體As-81647與黃化類病變突變體nec-t都屬于自然葉色突變，遺傳分析表明兩突變都是受一對隱性核基因控制，開始我們認(rèn)為As-81647是nec-t突變的一種類型，通過進(jìn)一步研究將As-81647定位在bin3.09區(qū)域，與nec-t突變基因定位區(qū)間明顯不同，證明兩突變基因并非等位基因。由于自然界中葉色突變時有發(fā)生，推測兩基因在突變進(jìn)程上可能并無太大關(guān)聯(lián)，只是同宗親本在不同方向上的突變。

MaizeGDB報道的28個表型相同或相近的突變基因均與白化基因As-81647處于不同位點(diǎn)且多數(shù)定位范圍較籠統(tǒng)。其中，黃白葉突變基因wl*-N4定位在bin3.05區(qū)域，與As-81647定位區(qū)間不同，兩突變體表型也略有差異，推斷兩突變基因?yàn)榉堑任换?；白化突變基因w*-062-3雖與As-81647定位在相同染色體上，但w*-062-3目前研究較少，無具體定位區(qū)間的報道，難以證明與As-81647基因是否等位，為判斷As-81647是否是新的突變基因需要與w*-062-3進(jìn)行進(jìn)一步的等位性分析。此外，As-81647基因定位區(qū)間內(nèi)尚有共分離的SSR標(biāo)記，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大群體縮小定位區(qū)間，并進(jìn)一步克隆該基因，為探討葉綠素合成過程及白化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Fambrini M， Castagna A， Vecchia F D， et al. Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower（Helianthus annuus L.） with abnormal chloroplast biogenesis， reduced PSⅡ activity and low endogenous level of abscisic acid[J]. Plant Science， 2004， 167（1）： 79-89.

[2] Jung K H， Hur J， Ryu C H， et al. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system[J]. Plant and Cell Physiology， 2003， 44（5）： 463-472.

[3] Chen G， Bi Y R， Li N. EGY1 encodes a membrane-associated and ATP-independent metalloprotease that is required for chloroplast development [J]. The Plant Journal， 2005， 41（3）： 364-375.

[4] 呂典華， 宗學(xué)鳳， 王三根， 等. 兩個水稻葉色突變體的光合特性研究[J]. 作物學(xué)報， 2009， 35（12）：2304-2308.

[5] Damaraju S， Schlede S， Eckhardt U， et al. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants [J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（12）： 1444-1451.

[6] Agrawal G K， Yamazaki M，Kobayashi M， et al.Screening of the rice viviparous mutants generated by endogenous retrotransposon Tosl7 insertion. Tagging of a zeaxanthin epoxidase gene and a novel osTATC gene[J]. Plant Physiology， 2001， 125（3）： 1248-1257.

[7] 馬志虎， 顏素芳， 羅秀龍， 等. 辣椒黃綠苗突變體對良種繁育及純度鑒定作用[J]. 北方園藝， 2001， 138（3）：13-14.

[8] 李小林， 鄧安鳳， 徐雨然， 等. 水稻葉緣白化葉色標(biāo)記三系不育系云豐88A的選育[J]. 種子， 2011， 30（12）：109-111.

[9] Gustafsson A. The plastid development in various types of chlorophyll mutations [J]. Hereditas， 1942， 28（3-4）： 483-492.

[10]王曉萌. 擬南芥白化突變體ems15的篩選和基因定位[D]. 上海： 上海師范大學(xué)， 2009.

[11]Han C D， Patrie W， Polacco M， et al. Aberrations in plastid transcripts and deficiency of plastid DNA in striped and albino mutants in maize[J]. Planta， 1993， 191（4）： 552-563.

[12]余慶波， 江 華， 米華玲， 等. 水稻白化突變體alb21生理特性和基因定位[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2005， 34（1）：70-75.

[13]鄭 靜. 一份水稻白化突變體的遺傳分析及其基因定位[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008.

[14]徐增漢， 何明雄， 陳登科， 等. 南丹白化煙葉研究初報[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36（33）：14609-14611，14695.

[15]韓 帥， 王麗靜， 鐘世宜， 等. 一個新的玉米葉色突變體的遺傳分析及基因定位[J]. 玉米科學(xué)， 2012， 20（3）：26-28.

[16]趙世杰， 史國安， 董新純， 等. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社， 2002：51-57.

[17]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社， 2001：134-137.

[18]王憲澤， 王保莉， 馮 炘， 等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2003：152-154.

[19]Michlmore R W， Papan I， Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis： A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of Sciences of United States of America， 1991， 88（21）： 9828-9832.