摘 要：從小立碗蘚（Physcomitrella patens）中克隆了細(xì)胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全長編碼序列，編碼區(qū)長1 509 bp，預(yù)測編碼488個氨基酸，蛋白二級結(jié)構(gòu)含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋，N端含有一個跨膜區(qū)域。構(gòu)建了PpCYP51G1的功能缺失載體，并利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得該基因的功能缺失轉(zhuǎn)化體；同時，構(gòu)建了PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PpCYP51G1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

關(guān)鍵詞：小立碗蘚；細(xì)胞色素P450；CYP51；克?。晦D(zhuǎn)化載體構(gòu)建

中圖分類號：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0001-07

CYP51為甾醇14α-去甲基化酶（又稱P45014DM），被視為最古老的細(xì)胞色素P450家族成員^[1]，是細(xì)胞色素P450家族中唯一一個在真菌、植物和動物界都具有保守功能的成員^[2]。真菌CYP51是真菌麥角甾醇合成過程的關(guān)鍵酶，抑制其活性將會阻礙麥角甾醇的合成，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致真菌死亡。目前農(nóng)業(yè)上CYP51抑制劑（14α-demethylation inhibitors，DMIs）類殺菌劑即是通過抑制真菌CYP51的活性發(fā)揮殺菌抑菌作用^[3]。植物CYP51不僅參與植物體的基礎(chǔ)代謝，還參與植物體的次生代謝，主要表現(xiàn)在次生代謝物質(zhì)的合成及降解化學(xué)藥物毒性兩方面，其催化的代謝途徑可產(chǎn)生一些重要次生代謝物， 提高植物抵抗病蟲害及逆境脅迫的能力^[4]。因此，研究CYP51對于研究細(xì)胞色素P450的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化具有重要意義。

小立碗蘚（Physcomitrella patens）是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有高頻率同源重組的植物^[5]。同源重組是基因打靶的技術(shù)核心。Kammerer^[6]和Cove^[7]等首先在小立碗蘚中實(shí)現(xiàn)了基因同源重組。隨后Schaefer等^[8，9]進(jìn)一步證實(shí)小立碗蘚基因打靶效率高達(dá)90%，與酵母基因打靶頻率（95%）相當(dāng)，這是高等植物中通過同源重組進(jìn)行精確基因打靶的先例。目前，基因打靶技術(shù)已成為研究小立碗蘚基因功能的有效工具^[10～13]。由于生活周期短、易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因植株易于分析以及核基因組易于和外源DNA發(fā)生同源重組等特點(diǎn)，小立碗蘚已成為重要的植物分子生物學(xué)研究材料。本試驗(yàn)克隆了小立碗蘚細(xì)胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1，并試圖利用其高頻率同源重組特性獲得該基因的功能缺失突變體并通過亞細(xì)胞定位研究其功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小立碗蘚Gransden品系Physcomitrella patens （Hedw.） B.S.G由Ralf Reski 教授惠贈。

試驗(yàn)所用試劑：pCAMBIA-1301載體、連有GFP的PJIT163質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌菌種（DH5α）、BioFlux膠回收試劑盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit）購自山東濟(jì)南朋遠(yuǎn)公司；Taq 酶、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、dNTP購自TaKaRa公司；pGEM-T easy vector System購自美國Promega公司；引物由北京博尚生物技術(shù)有限公司合成；Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（First-Strand cDNA Synthesis Kit）購自上海申能博彩生物科技有限公司；測序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心測序室完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PpCYP51G1全長cDNA編碼序列的克隆 采用Trizol法提取小立碗蘚原絲體總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（First-Strand cDNA Synthesis Kit）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以小立碗蘚反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用特異性引物PCYP51G1F：5′- GATACAATGGGGGATGCGGA-3′和PCYP51G1R：5′-ATCACATGTCAGTTGACGAC- 3′進(jìn)行PCR，獲得PpCYP51G1的全長編碼序列。

1.2.2 PpCYP51G1氨基酸序列特征分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站利用Blast工具進(jìn)行序列相似性分析；利用DNAMAN軟件預(yù)測其編碼蛋白并進(jìn)行蛋白序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建；利用GOR軟件（http：//www.expasy.ch/tools/） 對其蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對其蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3 PpCYP51G1功能缺失載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定 以基因組DNA為模板，利用引物PCYP51G1F和PCYP51G1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度大于1 kb的DNA片段，克隆測序，分析測序結(jié)果找出外顯子區(qū)域及內(nèi)含子區(qū)域，并將基因打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)在外顯子區(qū)域，取打靶位點(diǎn)前后各約500 bp的片段，分別命名為Ⅰ片段、Ⅱ片段。擴(kuò)增PpCYP51G1的Ⅰ片段和Ⅱ片段所用引物分別為：

CYP51G1F1：5′-GACGTCGATTCTCCCGACTGGGTGAG-3′（劃線處為Aat Ⅱ 酶切位點(diǎn)）

CYP51G1R1：5′-GAATTCAGAACGAAGTGACCCACAAT-3′（劃線處為EcoR Ⅰ 酶切位點(diǎn)）

CYP51G1F2：5′-ACTAGTCGCGTGGAATCGGAAGCGAC-3′ （劃線處為Spe Ⅰ 酶切位點(diǎn)）

CYP51G1R2：5′-GAGCTCGCTGCAAAGCAAAACCCCGA-3′ （劃線處為Sac Ⅰ 酶切位點(diǎn)）

pCAMBIA-1301載體（GenBank登陸號為AF234297.1）中帶有雙CaMV 35S啟動子、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt Ⅱ）及CaMV 3′UTR區(qū)的片段命名為Ⅲ片段（即pCAMBIA-1301載體上8 720～10 795 bp之間的片段），片段大小為2 076 bp，擴(kuò)增引物如下：

hpt-F：5′-AGCTTGCCAACATGGTGGAGCAC-3′

hpt-R：5′-AATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTAC-3′

分別將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ片段克隆到pGEM-T easy 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測序鑒定后，提取質(zhì)粒。首先用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ分別雙酶切連有Ⅱ和Ⅲ片段的質(zhì)粒（Ⅲ片段兩端的酶切位點(diǎn)為pGEM-T easy 載體自帶酶切位點(diǎn)），回收Ⅱ片段和連有Ⅲ片段的線性化質(zhì)粒，將二者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，經(jīng)測序鑒定后提取質(zhì)粒。再用Aat Ⅱ和EcoR Ⅰ雙酶切質(zhì)粒（pGEM-T easy 載體自帶酶切位點(diǎn)），同時用Aat Ⅱ和EcoRⅠ雙酶切連有Ⅰ片段的質(zhì)粒，將回收的Ⅰ片段與同時連有Ⅱ和Ⅲ片段的線性化質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，鑒定正確的即為我們需要的PpCYP51G1功能缺失載體。

以該載體為模板，以CYP51G1F1和CYP51G1R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小立碗蘚原生質(zhì)體。小立碗蘚原生質(zhì)體的制備、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、再生和轉(zhuǎn)基因植株的篩選參考王鳳德等^[14]的方法。

取選擇性培養(yǎng)基上生長的抗性植株及野生型植株，分別提取其DNA，以抗性植株DNA、野生型植株DNA以及構(gòu)建的質(zhì)粒載體為模板，用引物hpt-F和hpt-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定陽性植株。

1.2.4 PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及亞細(xì)胞定位 設(shè)計(jì)帶有BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增PpCYP51G1基因，所用引物為：CYP51G1-F：5′-GTGGATCCGATACAATGGGGGATGCGGA-3′和CYP51G1-R：5′-GTGGATCCATCACATGTCAGTTGACGAC-3′（劃線處為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)），將擴(kuò)增得到的目的片段通過BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)連接到PJIT163質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，進(jìn)行酶切及測序鑒定，插入方向正確的質(zhì)粒用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小立碗蘚原生質(zhì)體^[14]。

將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體25℃黑暗過夜培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpCYP51G1基因的克隆

以小立碗蘚反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用特異性引物PCYP51G1F和PCYP51G1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約為1.5 kb 的帶（圖1）。測序結(jié)果顯示，該基因的編碼區(qū)長1 509 bp，預(yù)測編碼488個氨基酸（圖2）；序列比對發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與擬南芥CYP51G1基因AtCYP51G1（GenBank登錄號為NM_101040）的編碼蛋白序列的一致性為65%，命名為PpCYP51G1。Blast 檢索發(fā)現(xiàn)基因組測序已經(jīng)完成的細(xì)菌、真菌和動物中都有PpCYP51G1基因的同源基因。

2.2 PpCYP51G1氨基酸序列特征分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.1 PpCYP51G1氨基酸序列同源性分析 對小立碗蘚、擬南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對（圖3）并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明，PpCYP51G1與擬南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1的氨基酸序列一致性分別為65%、64%、50%、28%。

2.2.2 PpCYP51G1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用GOR軟件（http：//www.expasy.ch/tools/） 預(yù)測了PpCYP51G1的二級結(jié)構(gòu)，如圖5所示，自由卷曲（random coil）占41.04%，伸展片段（extended strand）占16.46%，α-螺旋（alpha helix）占42.50%。對PpCYP51G1蛋白序列進(jìn)行了跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其N端具有一個跨膜區(qū)（圖6A）。為確定跨膜區(qū)的長度，逐個截短N(yùn)端序列，當(dāng)截短了22個氨基酸時， N 端沒有跨膜區(qū)（圖6B），說明跨膜區(qū)至少包括N端的22個氨基酸序列。

2.3 PpCYP51G1功能缺失載體鑒定

分別用Ⅰ片段兩個引物、Ⅱ片段兩個引物以及Ⅰ片段5′端引物/Ⅱ片段3′端引物進(jìn)行擴(kuò)增，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，均獲得了目的片段（圖7）。分別用Aat Ⅱ、EcoR Ⅰ雙酶切Ⅰ片段，用Spe Ⅰ、Sac Ⅰ雙酶切Ⅱ片段，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，均得到了目的片段。將PCR、酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目標(biāo)序列相符，表明PpCYP51G1功能缺失載體構(gòu)建成功，可用于下一步的轉(zhuǎn)化。

2.4 PpCYP51G1功能缺失轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定

隨機(jī)選取7株選擇性培養(yǎng)基上生長的抗性植株，分別提取其DNA及野生型植株DNA，以篩選出的抗性植株DNA、構(gòu)建的功能缺失載體質(zhì)粒、野生型植株DNA為模板，用hpt Ⅱ基因引物（hpt-F和hpt-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，獲得了PpCYP51G1功能缺失轉(zhuǎn)化體。

2.5 PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體鑒定及亞細(xì)胞定位

用BamH Ⅰ對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖8），得到了目的片段。將酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目標(biāo)序列相符，表明PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體構(gòu)建成功。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PpCYP51G1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

3 討論

本試驗(yàn)從小立碗蘚中克隆了CYP51基因PpCYP51G1的全長cDNA編碼序列，并對其氨基酸序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，CYP51G1在植物中具有較高的保守性，PpCYP51G1與擬南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1的氨基酸序列一致性分別為65%、64%、50%、28%，與細(xì)胞色素P450家族其它成員的研究結(jié)果類似^[14]，因此，研究小立碗蘚細(xì)胞色素P450家族基因的功能對于揭示它們在其它植物中的功能具有借鑒意義。

PpCYP51G1跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果表明，其N 端存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域，而GenBank中對小立碗蘚CYP51G1基因（GenBank登錄號為XM_001769361）的預(yù)測結(jié)果則顯示其編碼蛋白N端無跨膜區(qū)，原因是GenBank中預(yù)測的氨基酸序列不包括本試驗(yàn)得到的PpCYP51G1蛋白N端的前22個氨基酸（MGDAEMQGAPVGESAVFDRSKV），而這段序列剛好是預(yù)測的N端跨膜區(qū)。我們認(rèn)為PpCYP51G1的全長序列應(yīng)該包括這個跨膜區(qū)，GenBank中小立碗蘚EST數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)也證明這段序列是確實(shí)存在的。

此外，我們構(gòu)建了PpCYP51G1基因的功能缺失載體及GFP融合蛋白載體，獲得了PpCYP51G1的功能缺失轉(zhuǎn)化體，并對該基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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