摘 要：從浙江、山東、四川、江西采集的135株半夏樣品中分離出76株內(nèi)生拮抗菌，經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩和半夏離體塊莖復(fù)篩，篩選出2株拮抗真菌SC6和SC7，這2個(gè)菌株能完全抑制軟腐病的發(fā)生。通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS rDNA序列分析，鑒定菌株SC6和SC7均為曲霉屬土曲霉（Aspergillus terreus）。

關(guān)鍵詞：半夏；內(nèi)生真菌；拮抗；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.672 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）11-0103-04

半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit.]為天南星科多年生草本半夏屬植物，其塊莖可入藥，是一種重要的藥用植物[1，2]?，F(xiàn)代藥理研究證明半夏的主要功效有鎮(zhèn)咳祛痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)、抗心律失常、降血脂、抗腫瘤、抗早孕、鎮(zhèn)靜催眠、解毒抗炎、降血壓等，臨床應(yīng)用十分廣泛[3，4]。

自20世紀(jì)70年代開(kāi)始人工栽培半夏以來(lái)，半夏栽培面積逐漸擴(kuò)大。隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大，病害成了限制半夏種植的技術(shù)瓶頸之一，其中軟腐病危害最為嚴(yán)重，所以盡快開(kāi)展半夏軟腐病的生物防治研究已成為亟待解決的問(wèn)題。在生物防治方面，植物內(nèi)生菌是一類(lèi)潛力巨大、應(yīng)用前景廣闊的資源微生物，關(guān)于內(nèi)生菌作為生防因子的研究很多，并由此開(kāi)發(fā)出一些生防菌劑[5]。近年來(lái)，國(guó)外已有內(nèi)生細(xì)菌用于馬鈴薯、水稻、棉花、玉米、甘藍(lán)、白菜、番茄和水果產(chǎn)后病害防治的報(bào)道；國(guó)內(nèi)針對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病、番茄青枯病、辣椒炭疽病等病原菌也進(jìn)行了內(nèi)生菌的生防研究[6]，顯示了內(nèi)生菌作為生物農(nóng)藥的良好前景。但內(nèi)生真菌應(yīng)用于軟腐病防治的研究報(bào)道較少。

本文主要從半夏中分離內(nèi)生真菌，進(jìn)行初步的拮抗篩選及鑒定，為探索內(nèi)生菌對(duì)半夏軟腐病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品來(lái)源：用于內(nèi)生真菌篩選的樣品為采自浙江、山東、四川、江西半夏種植地的135株健康和發(fā)病較輕的半夏植株，保存于牛皮紙袋。

半夏軟腐病原菌：由浙江理工大學(xué)生物工程研究所分離保存的胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）SXR1菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理及消毒

將各處理置于28℃培養(yǎng)箱中，7 d后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)。重復(fù)3次。

1.2.6 18S rDNA的ITS序列分析

③核酸序列數(shù)據(jù)的分析和系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建：將2個(gè)菌株ITS序列用NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，用鄰近法（NJ）進(jìn)行聚類(lèi)分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離

從浙江、山東、四川和江西的半夏種植地共采集半夏135株，按根、球莖和莖分別進(jìn)行內(nèi)生菌的分離，共獲真菌分離物76株，其中地上莖分離出11株，球莖42株，根部23株；從浙江采集的半夏樣品中分離出38株，山東半夏樣品中19株，四川半夏樣品中10株，江西半夏樣品中9株。

2.2 拮抗菌初篩

用平板對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)76個(gè)真菌分離物進(jìn)行拮抗效果篩選，結(jié)果篩選出2株拮抗真菌SC6和SC7，抑菌圈直徑均在20.7 mm左右，如圖1所示。

注：圖為接種病原菌后培養(yǎng)24 h時(shí)拮抗真菌SC6的拮抗效果。拮抗真菌SC7與SC6效果圖相仿，僅提供SC6的效果圖。下同。

圖1 內(nèi)生拮抗菌對(duì)半夏軟腐病的抑菌效果

2.3 拮抗菌復(fù)篩

以半夏球莖為篩選材料，由圖2知，A、B、C均未發(fā)病，而D嚴(yán)重發(fā)病，說(shuō)明該2個(gè)拮抗菌SC6和SC7不僅對(duì)半夏不具有致病力，而且均可有效抑制半夏離體塊莖上軟腐病的發(fā)生，表現(xiàn)出良好的防效，防治效果高達(dá)100%。

A：CK（陰性對(duì)照）；B：拮抗菌；C：拮抗菌+病原菌；D：病原菌（陽(yáng)性對(duì)照）

圖2 內(nèi)生拮抗菌對(duì)半夏球莖軟腐病的抑制效果

2.4 拮抗真菌形態(tài)特征

將內(nèi)生拮抗真菌SC6和SC7分別接種于PDA平皿中培養(yǎng)，菌落和菌體形態(tài)見(jiàn)圖3和圖4。2個(gè)菌的形態(tài)均呈白色，初平坦，漸漸表面呈絨狀，生長(zhǎng)后期菌落中間呈現(xiàn)沙褐色，菌落反面呈黃色；分生孢子梗光滑無(wú)色，有隔膜，頂端膨大成半球形泡囊，從泡囊的頂部至2/3處密生小梗，小梗雙層，分生孢子串生于小梗頂端，分生孢子頭緊密直柱狀，分生孢子小而光滑，近球形。經(jīng)上述形態(tài)觀察初步鑒定為半知菌亞門(mén)絲孢菌綱從梗孢目叢梗孢科曲霉屬。

2.5 18S rDNA的ITS序列分析

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖5，擴(kuò)增條帶大小約600 bp。

M： Marker；1：SC6；2：SC7

圖5 拮抗真菌SC6 和SC7的18S rDNA的

ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

將2個(gè)菌株ITS序列用NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示二者之間同源性高達(dá)99.9%，只相差一個(gè)堿基，結(jié)合上述形態(tài)特征，確定SC6與SC7為同一種菌。用鄰近法（NJ）對(duì)2個(gè)菌株的ITS序列及相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，SC6結(jié)果如圖6所示（SC7未列出）?？梢钥闯?，菌株SC6與曲霉屬土曲霉（Aspergillus terreus）聚為一簇。

根據(jù)真菌SC6和SC7的菌落照片、菌體照片以及18S rDNA ITS測(cè)序結(jié)果可以判定菌株SC6、SC7均屬于半知菌亞門(mén)絲孢菌綱叢梗孢目叢梗孢科曲霉屬土曲霉（Aspergillus terreus）。

圖6 拮抗真菌SC6的18S rDNA ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗(yàn)所分離的內(nèi)生真菌相對(duì)較少，可能的原因有：一方面本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為常規(guī)的PDA培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)成分不一定適合所有種類(lèi)內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致真菌分離受到局限；另一方面采用組織研磨稀釋法分離，在研磨過(guò)程中，可能會(huì)有一些菌不能進(jìn)入上清液，從而使最終統(tǒng)計(jì)數(shù)量比實(shí)際數(shù)量偏低。另外，因真菌在半夏組織中含量本來(lái)就比較少，采用梯度稀釋法不利于含量較低的真菌培養(yǎng)，從而影響最終分離結(jié)果。

參 考 文 獻(xiàn)：

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[2] 范美華，周吉源.半夏的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2004，19（2）：90-92.

[3] 張小斌，唐養(yǎng)璇.商洛半夏塊莖腐爛病的原因初探及防治對(duì)策[J].商洛師范專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2006，20（2）：37-39.

[4] 徐 萍，張學(xué)蘭，吳暢灝.半夏的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2003，12（3）：76-77.

[5] 孔慶科，丁愛(ài)云.內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，32（2）：256-260.

[6] 石晶盈，陳維信，劉愛(ài)媛.植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)， 2006，26（7）：2395-2401.

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