龔福明，宋園亮，張忠華，李曉然，羅義勇，柳陳堅

1(昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院應用微生物研究室，云南昆明，650500)

2(德宏職業(yè)學院基礎系，云南芒市，678400)

豆豉是以大豆為主要原料，經(jīng)由原料處理、制曲及后發(fā)酵三階段釀制而成，不僅風味獨特，而且富含多種生理活性物質(zhì)，因而具有開胃增食、消積化滯、驅(qū)風散寒及預防心腦血管疾病等功能。雖然中國豆豉歷史悠久，然而傳統(tǒng)作坊式生產(chǎn)及研究起步晚等因素導致缺乏相應的科研成果。與之相比，納豆(Natto)和天培(Tempeh)則分別建立以Bacillus natto sawamura及Rhizopus oligosporus NRRL2710作為發(fā)酵菌種［1-2］的純種發(fā)酵工業(yè)模式。因此，有必要分析豆豉發(fā)酵參數(shù)及發(fā)酵菌群，以期篩選出符合制曲要求的微生物進行純種發(fā)酵，實現(xiàn)豆豉生產(chǎn)的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化。

研究發(fā)現(xiàn)，豆豉后發(fā)酵階段存在諸如枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌、短乳桿菌、屎腸球菌及嗜酸片球菌等乳酸菌［3-4］。其中的枯草芽孢桿菌能通過分泌多種生物酶來水解蛋白并產(chǎn)生水溶性氮，從而降低豆粒硬度，利于發(fā)酵。乳酸菌則能通過合成與有機酸代謝、脂肪分解及維生素合成等相關的酶系，來分解發(fā)酵基質(zhì)中的糖類、脂肪和多肽等化合物而產(chǎn)生各種風味物質(zhì)及生理活性物質(zhì)，最終達到提高食品營養(yǎng)價值、改善風味、延長食品保質(zhì)期，增強豆豉生理保健機能的目的［5］。

本研究運用分離自云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的Bacillus subtilis SP-8-5(GenBank No.JX993830)與Lactobacillus plantarum YM-5-2(GenBank No.GU369765)進行兩步固態(tài)發(fā)酵釀制功能性豆豉。經(jīng)該工藝發(fā)酵得到一種風味良好、感官極佳、保質(zhì)期長且具有極強纖溶酶活性的豆豉，以期為生產(chǎn)新型功能性混合發(fā)酵豆豉奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗用菌株

分離自云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的8株具有高產(chǎn)豆豉纖溶酶活性的枯草芽孢桿菌(菌株編號依次為LC-2-1，SP-8-5，LC-6-3，JS-13-1，JS-6-2，JS-1-2，ZT-13 和 JS-1-3)、2 株乳酸菌，Lactobacillus plantarum YM-5-2和Lactobacillus brevis GJ-1-3(GenBank No.JX993837)，上述菌株均保存于昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院應用微生物研究室。

1.1.2 實驗用大豆及對照樣品

原料大豆為金谷散裝大豆;對照樣品:香蔥豆豉及牛肉豆豉;花芝麻豆豉及太和豆豉;老干媽風味豆豉;干煸肉絲油辣椒豆豉;花大門豆豉及風吹豆豉;日本納豆。以上原料均購于昆明各大超市。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基

(1)50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)精確秤取15.4 g Na2HPO4和1.25 g NaH2PO4溶于蒸餾水，定容至1 000 mL，121℃滅菌后即為50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液。

(2)纖維蛋白含量0.3%的瓊脂糖平板制備［6］:將3.0 g纖維蛋白溶于500 mL滅菌磷酸鹽緩沖液(濃度50 mmol/L，pH7.4)中攪拌過夜;然后將10 g瓊脂糖溶于500 mL滅菌磷酸鹽緩沖液(濃度50 mmol/L，pH7.4)，待瓊脂糖溶液冷卻至70℃時將二者混勻制平板，每個平板25 mL，待凝固后打孔(打孔直徑為6.0 mm)。

(3)MRS肉湯培養(yǎng)基［pH(6.2±0.2)，Oxoid］。除特別注明，所有試劑均為分析純。

1.2 方法與步驟

1.2.1 豆豉發(fā)酵工藝流程

豆豉種類繁多，釀造工藝復雜，但主要分為前處理(即原料處理)、制曲及后發(fā)酵3個階段［7-12］，本研究所使用的釀造工藝基本上也分成3個階段，只是在制曲時采用了兩步固態(tài)混合發(fā)酵，其主要釀造工藝流程見圖1。

圖1 豆豉的發(fā)酵工藝流程Fig.1 The flow chart of Douchi processing

1.2.2 原料豆的處理

按1∶3的浸泡比例于室溫 (20℃)連續(xù)浸泡24 h，每隔2 h檢查一次大豆的浸泡程度。將浸泡好的大豆瀝干后放入器皿中，紗布封口后分別于108℃、110℃、115℃、118℃及121℃高壓蒸煮，以確定蒸煮溫度和時間對大豆的影響。

1.2.3 發(fā)酵制曲

1.2.3.1 豆豉發(fā)酵制曲

(1)種子液制備及擴大培養(yǎng):將上述8株高產(chǎn)豆豉纖溶酶的枯草芽孢桿菌保存液解凍，分別吸取30 μL菌種液接種至5 mL滅菌營養(yǎng)肉湯中 (杭州天和微生物試劑)，35℃振蕩(170 r/min)培養(yǎng)48 h，隨后將該種子液按2%(v/v)的比例接種至40 mL滅菌營養(yǎng)肉湯中振蕩培養(yǎng) (35℃，170 r/min，48 h)，培養(yǎng)結(jié)束后離心棄上清液(4℃，8 000 r/min，10 min)，用25 mL滅菌生理鹽水洗脫菌體2次;乳酸菌則按上述步驟將菌株分別接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中進行菌種復壯、擴大培養(yǎng)及菌體處理，培養(yǎng)條件為35℃靜置48 h。

(2)枯草芽孢桿菌的耐鹽性分析:分別將50 μL復壯活化的枯草芽孢桿菌種子液接種至NaCl濃度為0%、3%、4%、5%、6%、7%的營養(yǎng)肉湯中振蕩培養(yǎng)24 h(35℃，170 r/min)，培養(yǎng)結(jié)束后對培養(yǎng)液進行適當稀釋，于600 nm處測定菌體濃度［13-15］，進而初步確定菌株耐鹽性。

(3)豆豉發(fā)酵制曲條件探討:將耐鹽菌株分別接種至100 g經(jīng)蒸煮處理并冷卻至30℃的大豆中，隨后分別置于20℃、23℃、26℃、29℃、32℃、35℃及37℃發(fā)酵42 h，并以菌體生長量及感官評定值為評價標準確定最佳發(fā)酵溫度。最終將豆豉在最適發(fā)酵溫度(26℃)下連續(xù)發(fā)酵54 h，在發(fā)酵24 h后每間隔6 h取樣1次，并根據(jù)豆豉發(fā)酵程度及感官評定結(jié)果確定豆豉最佳發(fā)酵時間。

(4)感官評定對16名食品專業(yè)的老師和學生(男女各半)進行基本的感官評價培訓后按表1體系進行評價，評價完一個樣品后休息1 min，并用純凈水漱口后再評定下一個樣品。將16份感官評定的各項目得分求均值后再將各項目得分均值加合即為總得分，總得分越高表明豆豉感官越好，越容易被消費者接受。

1.2.3.2 鹽含量對B.subtilis SP-8-5發(fā)酵豆豉纖溶酶活性及活菌數(shù)影響

(1)鹽含量對發(fā)酵豆豉中酶活性影響:在發(fā)酵半成品豆豉中分別添加 0%、1%、2%、3%、4%、5%NaCl，4℃后發(fā)酵72 h，隨后分別秤取豆豉樣品1.0 g，添加至5 mL滅菌生理鹽水振蕩混勻，4℃浸泡24 h后的離心上清液(4℃，8 000 r/min)即為豆豉纖溶酶粗酶液。分別將50 μL豆豉纖溶酶粗酶液滴加至0.3%纖維蛋白平板 (平板使用前先進行30 min紫外滅菌)，待粗酶液完全被吸收后，35℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并測量纖溶圈直徑，以纖溶圈大小來初步測定豆豉纖溶酶活性。

(2)豆豉中活菌數(shù)測定:分別秤取樣品豆豉1.0 g，用5 mL滅菌生理鹽水，4℃浸泡6 h，混勻后選適宜稀釋度的菌液20 μL涂營養(yǎng)肉湯瓊脂平板，35℃倒置培養(yǎng)48 h后計數(shù)(計數(shù)時瓊脂平板菌落數(shù)應在30～300之間)。此外，對9個市售豆豉樣品的纖溶活性及活菌數(shù)進行測定并與樣品豆豉比較。

表1 豆豉感官評價Table 1 The sensory evaluation experiment of Douchi

1.2.4 乳酸菌的二次發(fā)酵制曲

1.2.4.1 乳酸菌與B.subtilis SP-8-5的拮抗實驗

(1)乳酸菌復壯活化:將乳酸菌解凍混勻后各取30 μL接種至5 mL滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中復壯(35℃，靜置48 h);隨后按2%的接種比例用50 mL滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)(35℃，靜置36 h)。

(2)采用spot-on-lawn法研究乳酸菌對B.subtilis SP-8-5的拮抗作用，用MRS瓊脂培養(yǎng)基做基層平板，將5 μL適當稀釋的乳酸菌菌液(106CFU/mL)滴加至基層平板中央，待其完全吸收后35℃靜置培養(yǎng)48 h;隨后將含有20 μL指示菌液(106CFU/mL)營養(yǎng)軟瓊脂培養(yǎng)基(0.75%瓊脂)迅速平鋪于已培養(yǎng)48 h的基層培養(yǎng)基上，35℃靜置培養(yǎng)24 h后觀察抑菌現(xiàn)象。

1.2.4.2 乳酸菌發(fā)酵對豆豉感官評價影響

將1.6 kg大豆按最佳條件進行初步發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后分4組:A組為對照;B組接種50 mL L.brevis GJ-1-3菌液;C組接種50 mL L.plantarum YM-5-2菌液;D組接種25 mL L.brevis GJ-1-3菌液及25 mL L.plantarum YM-5-2菌液，30℃靜置發(fā)酵48 h后，4℃后酵48 h，即為成品豆豉。最后按表2體系進行感官評價，得分越高表明其感官越好，越容易被消費者接受。

表2 乳酸菌發(fā)酵豆豉的感官評價Table 2 The sensory evaluation experiment of lactic acid bacteria fermented Douchi

1.2.4.3 乳酸菌對豆豉后發(fā)酵影響

(1)乳酸菌發(fā)酵對豆豉纖溶酶活性及枯草芽孢桿菌活菌數(shù)影響:參照1.2.3.2方法檢測乳酸菌發(fā)酵后成品豆豉中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)變化及其纖溶酶活性。

(2)樣品豆豉pH值變化:分別取后發(fā)酵3 d、7 d、14 d、21 d、26 d、31 d、45 d 及 61 d 時的成品豆豉1.0 g，于5 mL滅菌生理鹽水4℃浸泡24 h后用便攜式pH計(pH BOY-KS723;日本AS ONE)測定離心上清液的pH值(4℃，8000 r/min，8 min)。

(3)樣品豆豉中維生素含量變化將乳酸菌二次發(fā)酵后14 d的樣品豆豉送至云南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗測試中心對部分維生素(葉酸、煙酸、VB6、VB5等)含量進行分析測定。

(4)豆豉樣品貨架期將完成發(fā)酵的豆豉置于4℃及室溫下跟蹤觀察霉變情況及風味變化，以分析確定成品豆豉的貨架期。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料豆前處理

前處理(即原料處理)是豆豉釀制的首要環(huán)節(jié)，只有經(jīng)過充分前處理的大豆才有利于微生物附著制曲。本研究顯示，大豆按1∶3的比例于室溫(20℃)浸泡10 h，110℃蒸煮20 min，此條件浸泡時無泡沫出現(xiàn)，豆粒含水量適宜且軟硬合適，蒸煮后豆粒柔軟且散發(fā)濃郁豆香味，用手壓后種皮易被搓破。

2.2 發(fā)酵制曲

2.2.1 溫度對制曲影響

枯草芽孢桿菌于26℃，發(fā)酵42 h后豆豉產(chǎn)生大量拉絲物質(zhì)并伴有濃郁豉香。

2.2.2 制曲菌株耐鹽性

本研究所使用的8株枯草芽孢桿菌均顯示較強耐鹽性，其中B.subtilis SP-8-5和B.subtilis ZT-13的耐鹽性尤為突出;鹽添加量為7%時，2菌株所發(fā)酵豆豉的活菌數(shù)分別為(1.87±0.02)×109CFU/mL與(1.97±0.02)×109CFU/mL，與空白對照組相比差異不顯著［分別為(2.41±0.02)×109CFU/mL和(2.11±0.02)×109CFU/mL］，當鹽添加量為4%時，反而能促進B.subtilis SP-8-5的生長(樣品活菌數(shù)可高達4.85×109CFU/mL)。

2.2.3 感官評價

按表1體系感官評定結(jié)果表明，B.subtilis SP-8-5發(fā)酵效果最好，其總分值達20.8，具體表現(xiàn)為該發(fā)酵豆豉無論外觀、氣味、滋味還是總體接受度各方面的評定分值均為最佳。

2.3 鹽含量對B.subtilis SP-8-5發(fā)酵豆豉的影響

2.3.1 鹽添加量對豆豉纖溶酶活性影響

食鹽濃度低于4%時，其纖溶酶活性隨鹽添加量增加而增強，當鹽濃度大于4%時，其纖溶酶活性則呈負相關。B.subtilis SP-8-5菌株呈現(xiàn)很強耐鹽性，食鹽量為5%時，孵育24 h的纖溶直徑仍達(1.37±0.02)cm，為該菌株空白對照的62%。

2.3.2 樣品豆豉與市售豆豉比較

檢測結(jié)果表明，試驗菌株B.subtilis SP-8-5的發(fā)酵樣品中活菌數(shù)為(8.5×1010～5.6×1011)CFU/g，纖溶直徑則高達(2.21±0.02)cm，與9種市售豆豉比較結(jié)果見表3。B.subtilis SP-8-5發(fā)酵豆豉無論是活菌數(shù)還是纖溶酶活性均比云南常見市售豆豉高，而市售豆豉僅日本納豆的活菌數(shù)及溶血栓能力較強外，其余表現(xiàn)均較差。綜合考量各指標，遂將B.subtilis SP-8-5用作后續(xù)發(fā)酵制曲的種子菌種。

2.4 乳酸菌二次發(fā)酵對豆豉后發(fā)酵影響

2.4.1 乳酸菌對B.subtilis SP-8-5的抑制作用

應用spot-on-lawn法檢測乳酸菌對B.subtilis SP-8-5抑制作用結(jié)果表明 (圖 2)，L.brevis GJ-1-3和L.plantarum YM-5-2對B.subtilis SP-8-5的生長均有抑制作用，L.brevis GJ-1-3的抑菌圈直徑達2.89 cm(菌落直徑0.65 cm，圖3);而L.plantarum YM-5-2的抑制作用相對較弱(抑菌圈直徑2.57 cm，菌落直徑0.67 cm，圖2)。因此，為保證使用B.subtilis SP-8-5初步發(fā)酵制曲品質(zhì)，必需先使用B.subtilis SP-8-5進行充分發(fā)酵后，再接種乳酸菌進行二次發(fā)酵。

表3 B.subtilis SP-8-5發(fā)酵豆豉中活菌數(shù)及溶血栓能力與9種市售豆豉比較Table 3 The comparative results of living bacteria number and fibrinolytic enzyme activity between B.subtilis SP－8－5 fermented Douchi and nine commercial Douche

圖2 乳酸菌對B.subtilis的抑菌作用Fig.2 The antibacterial function of lactic acid bacteria against B.subtilis SP-8-5

2.4.2 乳酸菌二次發(fā)酵對樣品豆豉感官影響

按1.2.4.2實驗設計，在B.subtilis SP-8-5發(fā)酵制曲的半成品中接種乳酸菌進行二次發(fā)酵，30℃靜置發(fā)酵48 h后于4℃后酵48 h，即得成品豆豉。B.subtilis SP-8-5與L.plantarum YM-5-2混合發(fā)酵的豆豉按表2體系進行感官評價得分最高(15分)，因為經(jīng)L.plantarum YM-5-2二次發(fā)酵后，成品豆豉酯香味濃郁，能基本掩蓋B.subtilis SP-8-5制曲過程中所產(chǎn)生的氨味，后續(xù)實驗將以 B.subtilis SP-8-5與L.plantarum YM-5-2混合發(fā)酵為基礎，進行豆豉兩步固態(tài)發(fā)酵研究。

2.4.3 L.plantarum YM-5-2對豆豉后發(fā)酵影響

2.4.3.1 L.plantarum YM-5-2對豆豉樣品活菌數(shù)、pH值及纖溶酶活性影響

L.plantarum YM-5-2對樣品豆豉后發(fā)酵的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果見表4。隨著后發(fā)酵時間延長，活菌數(shù)有所下降，B.subtilis SP-8-5的數(shù)量下降尤為明顯(減少近6個數(shù)量級)，而L.plantarum YM-5-2活菌數(shù)則是先升后降，然而下降幅度只有1個數(shù)量級?；旌习l(fā)酵時的pH值變化則與L.plantarum YM-5-2活菌數(shù)變化呈正相關，隨著發(fā)酵早期菌體增加而逐漸酸化，后酵31天后，活菌數(shù)開始減少，酸度也逐漸降低，其pH值最終升至6.4?；旌习l(fā)酵時，樣品豆豉的纖溶酶活性則隨發(fā)酵時間延長而降低，然而混合發(fā)酵時，纖溶酶活性較B.subtilis SP-8-5單純發(fā)酵時略有上升，綜合考量各發(fā)酵指標，將 L.plantarum YM-5-2活菌數(shù)達(3.50±0.35)×1011CFU/g，B.subtilis SP-8-5活菌數(shù)達 (5.88±0.53)×108CFU/g，纖溶圈直徑 (2.99±0.06)cm時(48 h孵育)的后酵時間21 d確定為混合發(fā)酵的后酵時間。

表4 L.plantarum YM-5-2對樣品豆豉中活菌數(shù)、纖溶酶活性及pH值影響Table 4 Effects of L.plantarum YM －5－2 on living bacteria number，fibrinolytic enzyme activity and pH values of sample Douche

2.4.3.2 L.plantarum YM-5-2對樣品中維生素含量影響

表5結(jié)果顯示，發(fā)酵豆豉中幾種重要維生素含量較原料豆有所增加，其中葉酸含量增加最為顯著?；旌习l(fā)酵時，煙酸與VB5含量比B.subtilis SP-8-5單獨發(fā)酵時高，葉酸與VB6含量則較低，由此可推測L.plantarum YM-5-2在一定程度上能抑制B.subtilis SP-8-5生物合成某些B族維生素。

表5 兩種發(fā)酵樣品豆豉的維生素含量比較(mg/100 g)Table 5 Comparison of vitamin content between two fermented sample Douche

2.4.3.3 L.plantarum YM-5-2對豆豉貨架期影響

將混合發(fā)酵豆豉于室溫及4℃條件下進行實時追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樣品豆豉在室溫至少可以貯藏45 d，而在4℃則至少可以貯藏60 d;結(jié)合各項發(fā)酵指標，建議豆豉低溫(4℃)貯藏，同時貯藏期限不宜超過60 d。

3 討論

本研究運用從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中分離到的高纖溶活性菌株B.subtilis SP-8-5與產(chǎn)酸能力及抑菌效果均佳的L.plantarum YM-5-2進行兩步固態(tài)發(fā)酵。為利于菌種附著發(fā)酵，將大豆按1∶3的比例(水豆質(zhì)量比)室溫(20℃)浸泡10 h，110℃蒸煮20 min，冷卻至30℃時先接種B.subtilis SP-8-5，26℃發(fā)酵42 h，即得纖溶活性較高的豆豉曲，該發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)釀制工藝基本相似［16-19］。為提升風味，降低含鹽量，保證品質(zhì)并延長保質(zhì)期，本研究在初步制曲后，添加L.plantarum YM-5-2進行二次發(fā)酵，在二次發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量芳香物質(zhì)不僅能夠掩飾枯草芽孢桿菌在制曲過程中產(chǎn)生的氨味，同時還能賦予豆豉濃郁的醬香味。此外，混合發(fā)酵過程中該植物乳桿菌還能通過產(chǎn)生乳酸、苯乳酸及細菌素等抑菌物質(zhì)，對食源性致病菌發(fā)揮抑菌殺菌作用，從而能夠在不添加任何化學防腐保鮮劑的情況下延長豆豉貨架期，甚至利于實現(xiàn)低鹽乃至無鹽發(fā)酵。雖然經(jīng)過L.plantarum YM-5-2的二次發(fā)酵，樣品豆豉可在不添加任何食鹽的條件下，室溫貯藏45 d，4℃貯藏60 d，然而鑒于實際生產(chǎn)銷售周期，有必要探討長期保持豆豉纖溶酶活性及乳酸菌活菌數(shù)的發(fā)酵工藝，如能切實有效地解決該問題，將能大大提高功能性發(fā)酵豆豉的市場前景。

此外，隨著人們對豆豉深入了解與認識，不僅僅滿足于其風味，而且對其安全性及保健功效提出了更高要求?？莶菅挎邨U菌因能產(chǎn)生豆豉纖溶酶而廣泛用于豆豉發(fā)酵，乳酸菌則是一種有著重要生理功能的益生菌，因此被國際社會公認為食品安全級微生物并被廣泛用于醫(yī)療保健及食品工業(yè)。本研究就是在充分考慮兩種菌種各自優(yōu)勢的前提下，將二者有機結(jié)合開發(fā)出兩步固態(tài)發(fā)酵法，通過該發(fā)酵工藝處理后，每克豆豉樣品中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)可高達109個數(shù)量級，而植物乳桿菌的活菌數(shù)更是高達(3.50±0.35)×1011CFU/g，是國內(nèi)市售豆豉活菌數(shù)的數(shù)十倍乃至數(shù)百萬倍。同時，L.plantarum YM-5-2具有極強的耐酸耐膽鹽活性，因此該乳酸菌菌株進入人體后，能在腸道內(nèi)有效定植，并通過產(chǎn)生大量乳酸與苯乳酸等有機酸來發(fā)揮維持腸道菌群平衡的作用。而B.subtilis SP-8-5則能通過分泌枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等活性物質(zhì)來發(fā)揮維持腸道菌群平衡的作用。因此，相對市售豆豉而言，本研究所發(fā)酵的豆豉將有著巨大的市場發(fā)展前景。

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