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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003； 2 章丘市人民醫(yī)院腫瘤放療科)

胰腺癌是消化系統(tǒng)中較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多數(shù)病人就診時(shí)即處于中晚期，病死率高達(dá)90%，被認(rèn)為是可治療但不可治愈的疾病。放化聯(lián)合治療為其主要治療手段。但胰腺癌對(duì)放化療并不太敏感，常規(guī)放療模式靶區(qū)內(nèi)包括的正常組織多，限制了分次劑量及總劑量的提高，生物效應(yīng)劑量較低，局控率差，副作用大。立體定向放射治療(SRT)可提高單次放療劑量[1]，在短期內(nèi)完成治療，不會(huì)產(chǎn)生因時(shí)間延長(zhǎng)而導(dǎo)致的劑量耗損，有利于等效生物學(xué)劑量(BED)的提高，從而提高療效，但部分正常胰腺也會(huì)受到照射。目前有關(guān)同步放化療后正常胰腺損傷的基礎(chǔ)研究甚少。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察奧沙利鉑化療聯(lián)合單次大劑量照射后，胰腺組織發(fā)生的組織學(xué)及相應(yīng)指標(biāo)的改變，為放化療過(guò)程中胰腺等正常組織保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Wistar 大鼠80只，清潔級(jí)，均為雄性，體質(zhì)量為200～250 g，由青島市藥檢所提供。試劑：Bcl-2鼠抗人單克隆抗體、Bax兔抗人多克隆抗體及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒等,均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology Inc公司；40 g/L甲醛溶液由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供。所用儀器如下：旋渦混合器XW-80A；自制大鼠固定板；低溫高速離心機(jī)Contifuge Stratos；美國(guó)瓦里安23EX直線加速器；芬蘭Labsystems加樣器、Epics XL·MCL流式細(xì)胞儀等。

1.2 動(dòng)物分組及處理

將大鼠隨機(jī)分為化療組(A組)、放療組(B組)、同步放化組(C組)和對(duì)照組(D組)，各20只。A組給予腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg，B組給予6 MV X線12 Gy一次性照射大鼠腹部，C組腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg后隨即行6 MV X線12 Gy腹部照射。分別于照射后第3、7、14、21、42天，在深度麻醉下處死大鼠，每次4只。D組僅給予腹腔注射等量生理鹽水及假照，在相應(yīng)時(shí)間內(nèi)每次處死4只。大鼠處死后取胰腺組織，石蠟包埋。

1.3 胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察

胰腺組織用40 g/L的甲醛固定后經(jīng)取材、脫水、包埋、固定、切片等，行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察胰腺的組織學(xué)變化。

1.4 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(S-P法)[2]。Bcl-2、Bax陽(yáng)性細(xì)胞胞膜、胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。400倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)2 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率。細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組胰腺組織形態(tài)學(xué)比較

肉眼觀察，D組胰腺灰粉色，可見(jiàn)正常的胰腺小葉結(jié)構(gòu)，與周圍脂肪組織分界不清，腹腔液清；A組胰腺肉粉色，質(zhì)軟，腫脹，部分小葉結(jié)構(gòu)消失，腺體血管充血，腹腔液渾濁，與周圍組織稍有粘連；B組胰腺黃白色，質(zhì)硬，腫脹，與周圍組織有粘連，腹腔液渾濁；C組胰腺粉白色，質(zhì)脆，胰腺小葉分界不清，腺體血管明顯充血，與周圍組織明顯粘連，血性腹腔液。

光鏡下觀察，照射后第3天，A組少量腺細(xì)胞水腫紊亂，腺葉間少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；B組胰腺空泡變性，伴有胞漿水腫；C組大鼠胰腺出現(xiàn)較多空泡變性，胞漿水腫，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)片狀出血。第7天，A組胰腺腺體內(nèi)有較多炎癥細(xì)胞，血管充血，局部壞死；B組大片空泡變性，出現(xiàn)腺細(xì)胞萎縮,間質(zhì)出現(xiàn)纖維化；C組腺體炎癥浸潤(rùn)伴纖維組織增生，空泡變性廣泛，腺細(xì)胞萎縮，內(nèi)部分泌物減少，周圍間質(zhì)內(nèi)脂肪細(xì)胞變性。第14天， C組腺體仍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺葉組織變性，血管內(nèi)充血，空泡變性壞死，腺細(xì)胞減少并間質(zhì)纖維增生；A組及B組變化同C組，但較C組改變輕。第21天， A組周圍間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞幾乎消失； B組腺葉間隙變大,空泡變性基本消失，間質(zhì)纖維增生明顯；C組周圍間質(zhì)內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞，腺葉細(xì)胞變性，周圍間質(zhì)組織明顯纖維增生。第42天， A組胰管上皮細(xì)胞高柱狀排列清晰； B組腺細(xì)胞增殖活躍，可見(jiàn)腺泡上皮細(xì)胞異型，腺管內(nèi)充滿分泌液；C組腺管內(nèi)分泌液較多，腺細(xì)胞增殖，胰腺小葉間、胰島細(xì)胞間及小葉內(nèi)胰管周圍纖維化明顯。

2.2 各組不同時(shí)間Bcl-2蛋白表達(dá)比較

在胰島細(xì)胞中，各時(shí)間點(diǎn)A、B、C組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率均較對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性(F=101.9～3 108.6,P<0.01)；各實(shí)驗(yàn)組在第7天表達(dá)率最低(F=1 014.3～3 584.4,q=17.4～146.5，P<0.01)，其中C組Bcl-2表達(dá)率最低，差異有顯著意義(q=3.0～18.3，P<0.01)。在腺泡細(xì)胞中,各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率均較對(duì)照組升高，差異有顯著性(F=39.9～135.1，P<0.01)；各實(shí)驗(yàn)組第7天表達(dá)率最低(F=812.1～1 049.7,P<0.01)，C組低于A、B、D組，差異有顯著意義(q=4.3～16.5，P<0.01)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組Bcl-2表達(dá)呈上升趨勢(shì)，第42天時(shí)，C組兩種細(xì)胞的Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率與A、B組相比較，差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、2。

2.3 各組不同時(shí)間Bax蛋白表達(dá)比較

在胰島細(xì)胞中，各實(shí)驗(yàn)組Bax陽(yáng)性表達(dá)率在第3、7天均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=178.5、195.9，P<0.01)；其中C組第7天表達(dá)率最高，與A、B、D組比較差異有顯著意義(q=6.7～12.0,P<0.01),自第14天起表達(dá)率逐漸低于對(duì)照組。在腺泡細(xì)胞中，各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均較對(duì)照組升高，第3、7、14天差異有顯著意義(F=4.6～24.4，P<0.01)；各實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在第3天最高(F=96.9～138.3，P<0.01),其中以C組表達(dá)率最高，與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=21.4～32.1，P<0.01)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組表達(dá)逐漸趨于陰性。見(jiàn)表3、4。

表1 各組胰島細(xì)胞Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

表2 各組腺泡細(xì)胞Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

表3 各組胰島細(xì)胞Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

表4 各組腺泡細(xì)胞Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

3 討 論

在我國(guó)，胰腺癌死亡率占所有惡性腫瘤的第5位，5年生存率<5%[2]。大約40%的病人就診時(shí)即為局部晚期，放化聯(lián)合治療已成為晚期胰腺癌的主要治療手段。近來(lái)有研究顯示，吉西他濱、奧沙利鉑和干擾素等在胰腺癌治療過(guò)程中均是可選擇的放療增敏劑。目前大劑量精確放療已成為提高療效的一個(gè)重要發(fā)展方向，立體定向體部放射治療(SBRT)等大分割治療模式的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)大劑量照射癌組織，縮短療程，從生物有效率的角度來(lái)說(shuō)是比較合適的選擇[3]。但由于呼吸運(yùn)動(dòng)、靶區(qū)勾畫(huà)、擺位誤差等原因，不可避免地會(huì)照射到部分正常胰腺，引起胰腺的放射性損傷，導(dǎo)致消化功能降低，增加糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。單次大劑量放療聯(lián)合化療對(duì)胰腺損傷的研究比較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察奧沙利鉑化療聯(lián)合單次大劑量照射大鼠腹部后胰腺組織的損傷情況，為大分割模式等臨床新技術(shù)的應(yīng)用提供一定的定性資料，為保護(hù)胰腺提供相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

放射治療原則是給予一定腫瘤體積準(zhǔn)確的、均勻的劑量；盡量提高治療區(qū)域的劑量，降低照射區(qū)正常組織受量范圍；根據(jù)Fowler公式，單次劑量越大，生物效應(yīng)越大[5]。近年來(lái)，立體定向適形技術(shù)的進(jìn)展為低分割大劑量照射提供了條件。但低分割放療也增加正常組織特別是晚反應(yīng)組織的損傷。呂紅英[6]報(bào)道，胰腺組織受到2、4、6、8 Gy的X線一次性照射后第7天,電鏡觀察可見(jiàn)線粒體腫脹，電子密度下降，內(nèi)有空泡，外分泌部?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)較整齊、發(fā)達(dá)，內(nèi)見(jiàn)酶原顆粒，而內(nèi)分泌部染色淡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)欠發(fā)達(dá)；照射后第14～21天時(shí)胰腺內(nèi)空泡少見(jiàn)，線粒體較完整，可見(jiàn)嵴；照射后第42天時(shí)核形態(tài)改變，異染色質(zhì)增多、斷裂。本文光鏡觀察結(jié)果與其吻合。說(shuō)明胰腺的形態(tài)及病理學(xué)改變與其受照劑量大小有關(guān)。

化療和放療治療腫瘤的主要機(jī)制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。奧沙利鉑是繼順鉑、卡鉑之后的具有細(xì)胞毒作用的第三代鉑類抗癌藥，以DNA為作用部位，鉑原子與DNA鏈形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，阻斷DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[4]。體內(nèi)外臨床前研究表明，奧沙利鉑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都有抗癌作用，尤其對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤具有顯著療效。放射損傷的靶標(biāo)是DNA，細(xì)胞受放射損傷后反應(yīng)包括細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)機(jī)制激活和死亡。射線導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一個(gè)主要途徑是激活細(xì)胞凋亡機(jī)制[8]。細(xì)胞凋亡即程序性死亡,是基因調(diào)控的主動(dòng)而有序的自我消亡的過(guò)程，是指連續(xù)性的不伴有炎癥反應(yīng)的細(xì)胞變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。目前已有研究表明，細(xì)胞內(nèi)Bax與Bcl-2的比值是決定化療敏感性的重要因素。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，并且Bax是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子[9]。Bcl-2與Bax結(jié)合，形成Bcl-2/Bax異源二聚體，兩者的比值決定了細(xì)胞接受調(diào)控信號(hào)后細(xì)胞的存活與否。當(dāng)Bcl-2表達(dá)水平高于Bax時(shí)，自身形成同源二聚體，細(xì)胞凋亡受到抑制；Bax表達(dá)水平高于Bcl-2時(shí)形成同源二聚體，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。正常胰腺細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)較少或不表達(dá)，Bcl-2表達(dá)較強(qiáng)；細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2表達(dá)常較弱。孫寶剛[10]研究顯示，放療前加入化療藥物可提高細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制可能與降低Bcl-2表達(dá)及提高Bax表達(dá)有關(guān)。本文研究中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的藥物劑量換算方法，預(yù)實(shí)驗(yàn)得出每只大鼠所用奧沙利鉑為15 mg/kg。研究結(jié)果顯示，放化療組的正常胰腺組織在照射后的一段時(shí)間內(nèi)損傷程度較單純放療組及單純化療組嚴(yán)重，可能與放化療引起DNA損傷較重，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，胰島細(xì)胞與腺泡細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率降低，Bax表達(dá)率升高，抗凋亡蛋白減少，凋亡蛋白增加有關(guān)；隨著時(shí)間的推移，同步放化組腺泡細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率升高，Bax表達(dá)由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?；胰島細(xì)胞Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性率逐步升高，Bax表達(dá)陽(yáng)性率下降，與單純放療組及單純化療組恢復(fù)一致。其機(jī)制可能是正常組織損傷后的代償性改變，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增高，凋亡蛋白Bax表達(dá)降低，從而降低凋亡的發(fā)生。本文結(jié)果與大多數(shù)研究結(jié)果相符。

綜上所述，奧沙利鉑化療聯(lián)合同期大劑量放療時(shí)正常胰腺的損傷較單純放療組及單純化療組嚴(yán)重，其機(jī)制可能與化療后放療加重DNA的損傷,激活細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞凋亡蛋白的增加，從而加重了細(xì)胞的損傷有關(guān)。提示臨床上同期放療化療結(jié)合時(shí)需適當(dāng)調(diào)整化療劑量及尋求放療的最佳范圍，以最大限度地減少胰腺的損傷。

[1] CHANG D T, SCHELLENBERG D, SHEN J, et al. Stereotactic radiotherapy for unresectable adenocarcinoma of the pancreas[J]. Cancer, 2009,115(3):665-672.

[2] 李曉麗,劉希光,程熙國(guó),等. 照射時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)小鼠LEWIS肺癌細(xì)胞殺傷作用影響[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2008,23(3):195-197.

[3] 楊愛(ài)潔,何信佳,安永恒,等. 單次大劑量X線照射對(duì)大鼠胰腺的損傷作用[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(4):316-318.

[4] 庫(kù)建偉,潘瑞華. 奧沙利鉑聯(lián)合希羅達(dá)治療晚期胃癌臨床觀察[J]. 山東醫(yī)藥, 2007,47(1):55-55.

[5] FOWLER J F, CHAPPEL R. Non small cell lung tumors repopulate rapidly during radiation therapy[J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, 2000,46(2):516-517.

[6] 呂紅英. 胃腸道腫瘤放療對(duì)胰腺生物學(xué)效應(yīng)影響的基礎(chǔ)研究[D]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 2005.doi:10.7666/d.y908904.

[7] STELLET H. Mechanisms and genes of cellular suicide[J]. Science, 1995,267(5203):1445-1449.

[9] 于文成,秦筱梅. 非小細(xì)胞肺癌Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005,41(2):149-153.

[10] 孫寶剛. 5-FU在大劑量放療中誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2006,23(2):127-129,封三.