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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021)

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，而在臨床上80%～90%的肝癌病例為肝細(xì)胞性肝癌(HCC)。HCC的發(fā)生是一個多因素、多階段的復(fù)雜過程，其發(fā)病的分子機(jī)制尚不清楚。研究表明，HCC的發(fā)生不僅與基因突變有關(guān)，抑癌基因啟動子區(qū)CpG序列異常甲基化導(dǎo)致的基因失活也是肝癌發(fā)生的一個重要途徑[1-3]。多腫瘤抑制因子p16和結(jié)腸腺瘤樣息肉基因(APC)是兩個重要的腫瘤抑制基因，其中p16基因是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子[1]，APC基因可控制細(xì)胞分裂過程中起關(guān)鍵作用的基因的表達(dá)[4]。已有研究結(jié)果顯示，肝癌、胃癌等多種腫瘤組織及血漿標(biāo)本中p16、APC基因的啟動子區(qū)域CpG島常發(fā)生異常甲基化[2,5-6]，但不同研究者報道的p16、APC基因甲基化在肝癌組織及血漿標(biāo)本的檢出率有一定差異，特別是基因甲基化在癌組織與對應(yīng)血漿標(biāo)本表達(dá)的情況存在較大差異。本研究采用實時熒光PCR技術(shù)測定86例病人HCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織、血漿中p16、APC基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況，分析p16、APC基因甲基化在癌組織與血漿標(biāo)本檢出情況及其與HCC病人臨床特征關(guān)系，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取2008年6月—2009年6月于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行外科切除術(shù)的HCC病人標(biāo)本86例，男69例，女17例；以24例正常人及良性肝病病人正常肝組織作為對照。全部病例均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)對HCC進(jìn)行分期。

1.2 標(biāo)本的獲取

術(shù)前采集受檢者外周靜脈血5 mL，2 h內(nèi)離心分別取血漿和血細(xì)胞置于1.5 mL塑料離心管中；病人手術(shù)時收集HCC組織及相應(yīng)的癌旁正常組織(取自距癌灶邊緣3～5 cm外觀正常的組織，均避開壞死、炎癥部位，編號與外周血標(biāo)本對應(yīng))標(biāo)本。所有標(biāo)本獲取經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人或家屬知情同意。

1.3 肝癌組織、癌旁正常組織和血漿標(biāo)本DNA的抽提

使用組織基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)按照試劑盒說明，進(jìn)行組織DNA的抽提；采用酚氯仿法進(jìn)行外周血標(biāo)本DNA的抽提。

1.4 p16、APC甲基化檢測

1.4.1DNA修飾 取15 μL DNA，加入5 μL M-2Dilution Buffer混勻，去離子水補足50 μL，37 ℃水浴15 min。根據(jù)試劑盒說明的要求，將DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾及純化，最終溶于40 μL TE溶液,-20 ℃保存。

1.4.2PCR檢測p16、APC甲基化狀態(tài) 引物序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μL：包括亞硫酸氫鈉修飾的模板1 μL(25 ng)，200 nmol/L的引物各0.5 μL， 2× Epitect HRM Master Mix(HotStarTaq 酶、DNA 聚合酶、EpiTect HRM PCR Buffer)5 μL，以去離子水補足至10 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 20 s，然后以適宜的溫度退火30 s，72 ℃退火40 s、95 ℃退火1 min，進(jìn)行50個循環(huán)，再95 ℃延伸1 min，最后20 ℃終止反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，在PCR儀上直接進(jìn)行高分辨熔解。對PCR產(chǎn)物以0.2 ℃/s的速度行55～90 ℃熔解曲線分析，通過分析熔解曲線直接判定甲基化情況。

1.5 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，癌組織、癌旁正常組織和對應(yīng)血漿之間甲基化率比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 p16和APC基因甲基化情況比較

本文24例正常肝組織未檢出p16和APC基因的異常甲基化。癌組織p16基因甲基化率明顯高于癌旁正常組織和對應(yīng)的血漿標(biāo)本(χ2=67.48、6.72，P<0.05)。癌組織中APC基因甲基化率也均明顯高于癌旁正常組織和對應(yīng)的血漿標(biāo)本(χ2=18.03、29.16，P<0.05)。肝癌組織及對應(yīng)血漿標(biāo)本p16、APC基因甲基化的一致率分別為65.4%、43.3%。見表2。

表1 甲基化特異性引物序列

表2 癌組織、癌旁組織及血漿標(biāo)本中基因甲基化率的比較(例(χ%))

2.2 癌組織及對應(yīng)血漿標(biāo)本基因甲基化率與臨床特征的關(guān)系

癌組織及對應(yīng)血漿標(biāo)本p16和APC基因甲基化率與病人年齡、性別、吸煙狀況、飲酒狀況、TNM分期、腫瘤大小以及甲胎蛋白(AFP)水平無相關(guān)性(P>0.05)。HBsAg陽性組病人肝癌組織及對應(yīng)血漿標(biāo)本p16基因甲基化率顯著高于HBsAg陰性組(χ2=5.60、5.67，P<0.05)。見表3。

3 討 論

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾形式，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)及維持細(xì)胞正常分化中起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。已有研究結(jié)果顯示，人類腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中眾多癌相關(guān)基因啟動子區(qū)CpG島存在高甲基化現(xiàn)象，如抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因、DNA修復(fù)基因等[1,4,7]。

p16和APC基因是兩個重要的多腫瘤抑制基因，其中p16基因產(chǎn)物是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子[1]，APC基因產(chǎn)物是Wnt信號傳導(dǎo)途徑的重要組成部分，可控制細(xì)胞分裂過程中起關(guān)鍵作用的基因的表達(dá)[4]。目前，國內(nèi)外已有大量有關(guān)p16和APC基因在腫瘤組織及血漿中異常甲基化檢測的研究報道，但結(jié)果仍存在一定差異。LOU等[8]研究結(jié)果顯示，肝癌組織p16基因啟動子區(qū)甲基化頻率顯著高于癌旁組織，而蔣磊等[9]研究結(jié)果則顯示，肝癌組織中p16基因異常甲基化率僅為30%(12/40)。同樣吳龍等[10]的研究結(jié)果顯示，肝癌組織APC基因甲基化率顯著高于癌旁及正常對照肝組織，認(rèn)為是APC基因甲基化參與了肝癌的形成。而YU等[11]報道，在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中均未檢測到APC基因甲基化，進(jìn)而推測APC基因甲基化可能在肝癌形成過程中不發(fā)揮作用。不同研究者結(jié)論不一致的原因可能與研究對象的例數(shù)、甲基化的檢測方法不同等有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，86例HCC組織p16和APC基因的甲基化頻率顯著高于相應(yīng)癌旁組織和血漿標(biāo)本，且差異有顯著性，這與LOU等[8]和吳龍等[10]的研究結(jié)果一致，提示抑癌基因甲基化可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素。

表3 肝癌病人p16、APC啟動子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系(例(χ%))

肝癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程，與多種致病因素有關(guān)，因此我們分析了癌組織與對應(yīng)血漿標(biāo)本中p16、APC基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、HBV感染、TNM分期、腫瘤大小等臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，HBsAg陽性者肝癌組織及其對應(yīng)血漿p16基因啟動子區(qū)甲基化頻率分別為66.2%和46.5%，顯著高于HBsAg陰性者，提示基因甲基化與HBV感染關(guān)系密切，其可能是導(dǎo)致HCC發(fā)生的一個重要因素[12]。另外，本研究結(jié)果還顯示，p16、APC基因甲基化狀態(tài)與TNM分期、腫瘤大小無關(guān)，提示兩種基因的失活可能均發(fā)生于癌變的初始階段。

由于癌組織的檢測在取材和檢測等方面存在操作不方便、難度較大、易給病人造成痛苦和創(chuàng)傷等問題，所以本研究同時檢測了血漿中p16、APC基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，癌組織和血漿標(biāo)本p16基因啟動子區(qū)甲基化的一致率為65.4%，血漿p16基因啟動子區(qū)甲基化頻率顯著高于癌旁組織，提示檢測血漿p16基因啟動子區(qū)甲基化在肝癌早期診斷方面可能具有輔助價值。然而，血漿標(biāo)本中APC基因啟動子區(qū)甲基化頻率與癌旁正常組織差異無顯著性，其在肝癌早期診斷方面能否作為非侵入性腫瘤診斷輔助方法有待進(jìn)一步研究。

總之，肝癌組織中p16、APC基因處于高甲基化狀態(tài)，此種狀態(tài)可能是肝癌發(fā)生過程中一個重要因素。研究肝癌病人特異性基因甲基化的狀態(tài)，有助于我們更深入地認(rèn)識基因甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為肝癌的預(yù)防、早期診斷及治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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