羅佳麗，王雪瑩，王孝榮，蔣和體*

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

甜橙(Citrus sinensis (L.) Osb.)是蕓香科柑橘屬植物，含有多種維生素、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)[1]，甜橙果酒以甜橙為原料經(jīng)發(fā)酵而得的低度飲料酒，風(fēng)味獨(dú)特[2]，酒中含有較多的浸出物，所含的VC、酚類等[3]化合物有助于預(yù)防心血管疾病和冠心病的發(fā)生，具有較高的營養(yǎng)保健功能。

酵母是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一[4-5]，直接影響到所釀果酒的口感和風(fēng)味[6-7]，決定果酒品質(zhì)的優(yōu)劣。目前甜橙果酒的酵母多為延用葡萄酒酵母或果酒干酵母，缺乏專用的酵母菌株，使得甜橙果酒風(fēng)味不突出。李銳等[8]以錦橙表皮和柑橘園土壤篩選出適于錦橙果酒釀造的酵母菌株，陳茂彬等[9]從柑橘自然發(fā)酵液中分離得到適合柑橘果酒發(fā)酵的酵母GJ-17，但關(guān)于篩選適合甜橙果酒的酵母菌株的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從中國柑橘研究所和三峽建設(shè)集團(tuán)柑橘品種園中甜橙果皮及果園土壤中分離篩選適合釀造甜橙果酒的優(yōu)良酵母菌株，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，研究其發(fā)酵性能，并比較篩選酵母菌株與果酒干酵母釀造的甜橙酒酒精度、殘?zhí)恰L(fēng)味物質(zhì)等品質(zhì)的差異，以期為菌株的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜橙及土壤采自重慶北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)及重慶忠縣新立鎮(zhèn)的柑橘果園。

引物NL1/NL4 北京華大生物有限公司；10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 美國Sigma公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

酵母菌F076：自重慶忠縣甜橙果皮中分離；酵母菌S017：自重慶歇馬鎮(zhèn)甜橙果園土壤中分離；對(duì)照菌株(CK)：(SY)果酒干酵母，購自安琪酵母股份有限公司。

富集培養(yǎng)基：含抗菌素(青霉素1000mg/L)的YPD液體培養(yǎng)基；分離培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；斜面保藏培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基(固體)；橙汁培養(yǎng)基：甜橙榨汁后添加0.05g/100mL果膠酶，42℃酶解2h，尼龍濾布過濾，3000r/min離心3min，取上清液。

酵母種子液：參考蔣和體等[10]的方法配制。

1.3 儀器與設(shè)備

Master Cycler Gradient梯度PCR儀、Gel2 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYYIII型電泳儀、瓊脂糖水平電泳槽 北京市六一儀器廠；DHP-300電熱恒溫培養(yǎng)箱 重慶永恒試驗(yàn)儀器廠；DSX-280A1不銹鋼手提式滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HWT-10C恒溫振蕩水浴 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；Supleco固相微萃取裝置、50/30μm DVB/CAR/ PDMS(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)萃取頭 美國Supelco公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分離

采集柑橘果園中不同品種新鮮、無損傷的甜橙果皮以及果園內(nèi)土壤作為酵母菌的分離樣品，取適量樣品加入到選擇性富集培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)48h[11]，梯度稀釋后在PDA平板上涂布，30℃培養(yǎng)1～2d。挑取典型的酵母菌菌落，劃線分離傳代培養(yǎng)2～3次獲得純培養(yǎng)[12]，鏡檢為純種后接入YPD斜面。果實(shí)中篩選的酵母從F001開始編號(hào)，土壤中篩選的酵母從S001開始編號(hào)，經(jīng)編號(hào)菌株于4℃保藏。

1.4.2 甜橙果酒酵母篩選

初篩：將分離得到的菌株按8%的接種量接種到15°Brix橙汁培養(yǎng)基中，采用杜氏小管發(fā)酵法[13]觀察各菌株的產(chǎn)氣速率及產(chǎn)氣量，初步比較起酵速率、發(fā)酵力，獲得產(chǎn)氣能力較強(qiáng)菌株。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株按8%的接種量接種到15°Brix橙汁培養(yǎng)基中，28～30℃靜置發(fā)酵7d，用酒精計(jì)法測(cè)定發(fā)酵液的酒精度，進(jìn)一步篩選產(chǎn)酒能力強(qiáng)的菌株，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)定。

三級(jí)篩選：耐酒精、SO2篩選。將復(fù)篩得到的菌株接入含9%、12%、15%、18%乙醇的橙汁培養(yǎng)基中，于28～30℃培養(yǎng)，分別在發(fā)酵開始后的12、24、36、48h觀察杜氏小管的產(chǎn)氣情況，篩選出對(duì)酒精的耐受性強(qiáng)的菌株。將復(fù)篩得到的菌株接入到含50、75、100、125、150、175、200mg/L SO2的橙汁培養(yǎng)基，于28～30℃培養(yǎng)，分別在發(fā)酵開始后的10、24、48h觀察杜氏小管的產(chǎn)氣情況，進(jìn)一步篩選出耐SO2的菌株。

1.4.3 篩選菌株鑒定

1.4.3.1 篩選菌株形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)：無菌環(huán)境條件下用接種環(huán)挑取活化后的酵母菌適量，在YPD平板上劃線，28～30℃培養(yǎng)24～48h后，直接觀察菌落特征。

個(gè)體形態(tài)：生理鹽水浸片法[14]。

1.4.3.2 分子生物學(xué)鑒定

DNA提取采用珠磨法[15-16]，以提取的基因組DNA為模板，以NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAA AAG-3’)和NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)為引物擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)域[17]，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[18]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的序列在國際核酸數(shù)據(jù)庫(NCBI)中BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用MEGA4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹圖譜，并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征鑒定目的菌株。

1.4.4 發(fā)酵性能測(cè)試

1.4.4.1 篩選酵母最適溫度的測(cè)定

將酵母種子液接入15°Brix橙汁培養(yǎng)基中，在不同溫度條件下恒溫培養(yǎng)72h，用酒精計(jì)法測(cè)定酒精度，依據(jù)酒精度的大小確定最適發(fā)酵溫度。

1.4.4.2 篩選酵母最適pH值的測(cè)定

將酵母種子液接入不同pH值的橙汁培養(yǎng)基(15°Brix)中，于最適發(fā)酵溫度條件下恒溫培養(yǎng)72h，用酒精計(jì)法測(cè)定酒精度，依據(jù)酒精度的大小確定最適發(fā)酵pH值。

1.4.4.3 篩選酵母產(chǎn)酒力與降糖速率測(cè)定

將酵母種子液接入到23°Brix橙汁培養(yǎng)基中，在最適溫度條件下發(fā)酵96h，每隔12h測(cè)定酒精度、總糖含量。

1.4.5 菌株對(duì)發(fā)酵甜橙果酒品質(zhì)的影響

將酵母種子液與活性干酵母(對(duì)照)接入到23°Brix橙汁中，于室溫條件下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒樣的總糖、酒精度、總酸、香氣成分等理化指標(biāo)，并從色澤、透明度、香氣、口感、典型性對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)定，綜合評(píng)定篩選出優(yōu)良甜橙酒酵母。

1.4.6 甜橙酒理化指標(biāo)測(cè)定

總糖、總酸、酒精度參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定。

1.4.7 甜橙酒香氣成分測(cè)定

1.4.7.1 甜橙酒香氣成分提取[8]

取甜橙酒6mL于20mL樣品瓶中， 40℃水浴平衡15min，插入經(jīng)老化的萃取頭(250℃老化40min)，頂空萃取35min后，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，解析5min。

1.4.7.2 GC-MS條件

色譜條件：色譜柱DB-5MS(30m×0.25mm，0.25μm)，進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：35℃保持4min，以10℃/min升至110℃，保持6min，以5℃升至150℃，保持2min，以7℃/min升至230℃，保持4min；載氣：高純He，載氣流量1.0mL/min。電離方式EI；電子能量70eV；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500u。

分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(NIST/WILEY)進(jìn)行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行人工譜圖解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

對(duì)采集的果實(shí)、土壤樣品進(jìn)行分離、純化后共得到酵母菌138株。其中，甜橙果皮樣品中共分離得到酵母菌112株，兩個(gè)果園土壤樣品中分離得到酵母菌26株。

2.2 篩選結(jié)果

2.2.1 初篩結(jié)果

表 1 酵母初步篩選結(jié)果Table 1 Results of preliminary screening

由表1可知，發(fā)酵10h產(chǎn)氣滿管的菌株有2株，發(fā)酵24h產(chǎn)氣滿管的菌株有7株，發(fā)酵48h產(chǎn)氣滿管的菌株有10株，搖動(dòng)這19支試管可聞到淡淡的酒香。這19株菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)氣能力和發(fā)酵力，保留這19株菌株進(jìn)行下一級(jí)篩選。

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果

復(fù)篩在初篩的基礎(chǔ)上，以酒精度為指標(biāo)，進(jìn)一步比較各株酵母的發(fā)酵能力并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)定。19株酵母中產(chǎn)酒力大于7%的酵母菌3株，酒精度為5%～6%、6%～7%的分別有5、4株，剩余7株產(chǎn)酒力低于5%。產(chǎn)酒力高于5%的12株酵母發(fā)酵得到的果酒酒香濃郁，略有橙子的酸澀味，風(fēng)味典型，可以滿足甜橙果酒的生產(chǎn)要求，進(jìn)入第3次篩選。剩余的7株酵母產(chǎn)酒力較低，風(fēng)味略差，故不予考慮。

2.2.3 三級(jí)篩選結(jié)果

表 2 耐酒精力菌株的篩選結(jié)果Table 2 Screening of alcohol tolerant strains株

表 3 耐二氧化硫菌株的篩選結(jié)果Table 3 Screening of SO2 tolerant strains株

由表2可知，復(fù)篩得到的12株酵母酒精耐受能力均在9%以上。其中，11株耐受12%酒精度，6株耐受15%酒精度，4株耐受18%酒精度。果酒生產(chǎn)中，SO2添加量一般為50～100mg/L[11]，由表3可知，受試的12株菌株大部分滿足生成要求。

綜合三級(jí)篩選和感官評(píng)定，得到兩株符合優(yōu)良果酒酵母的標(biāo)準(zhǔn)的菌株，編號(hào)為F076和S017，這兩株菌種在發(fā)酵開始后24h內(nèi)產(chǎn)氣，并在發(fā)酵開始后48h內(nèi)產(chǎn)氣量達(dá)到杜氏小管滿管，產(chǎn)酒力分別為6.8%、7.5%，均能耐受15%以上的酒精，SO2耐受性分別為150、175mg/L。經(jīng)感官評(píng)定，兩者典型性最好，香氣最為濃郁，因而將菌株F076和S017保留，進(jìn)行下一步鑒定。

2.3 鑒定結(jié)果

2.3.1 酵母菌的形態(tài)觀察

圖 1 酵母菌株F076和S017的菌落和個(gè)體形態(tài)Fig.1 Colony and microscopic characteristics of yeast F076 and S017

菌株F076、S017的菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)如圖1所示，二者的菌落形態(tài)為圓形、乳白色，表面光滑、有凸起，質(zhì)地松軟、易挑，有悅?cè)说木葡阄?，是典型的酵母菌菌落[14]。F076的菌落直徑為(1.72±0.32)mm，S017為(1.23±0.47)mm。菌株F076與S017個(gè)體形態(tài)均為卵圓形，出芽生殖方式均為一端出芽。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

圖 2 酵母菌株S017、F076 26S rDNA D1/D2 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of amplification products of 26S rDNA D1/D2 from yeast S017 and F076

圖 3 酵母菌株S017、F076進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast S017 and F076

以玻璃珠破壁法提取酵母的基因組 DNA，以NL1/NL4為引物擴(kuò)增酵母26S rDNA的D1/D2區(qū)域，擴(kuò)增出的片段長度大約為600bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司測(cè)序，將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，得到與其親緣關(guān)系相近的已知酵母菌的相關(guān)信息，并采用 MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示，S017、F076與葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)相似度非常高，結(jié)合形態(tài)學(xué)的特征，可得知這兩株菌株為的葡萄汁有孢漢遜酵母不同菌種。

2.4 篩選酵母發(fā)酵特性研究

2.4.1 篩選酵母最適發(fā)酵溫度

圖 4 酵母菌株S017、F076最適溫度Fig.4 Optimal fermentation temperature for yeast S017 and F076

發(fā)酵溫度變化對(duì)這兩株菌株發(fā)酵有較大的影響，在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高酒精含量增加，超過一定溫度酒精含量隨著溫度的升高迅速降低。由圖4可知，S017的最適發(fā)酵溫度為24℃，F(xiàn)076的最適發(fā)酵溫度為30℃。優(yōu)良的釀酒酵母應(yīng)具有低溫發(fā)酵能力，一般果酒的適宜發(fā)酵溫度在16～23℃之間[19]，S017在此溫度內(nèi)產(chǎn)酒力明顯高于F076。

2.4.2 篩選酵母的最適pH值

圖 5 酵母菌株S017、F076的最適pH值Fig.5 Optimal fermentation pH for yeast S017 and F076

圖5為S017、F076在不同pH值橙汁條件下發(fā)酵72h后酒精度，pH值的變化對(duì)這兩株菌株發(fā)酵均有不同程度的影響，從整體的發(fā)酵趨勢(shì)看，pH值的升高或降低對(duì)S017發(fā)酵力的影響較大，在pH值為5.0時(shí)酒精度達(dá)到最大，pH值高于或低于5.0時(shí)S017酒精含量明顯下降。F076在pH值為5.5時(shí)酒精含量最大，在pH4.5～5.5之間酒精含量差異不大。

2.4.3 發(fā)酵過程中殘?zhí)?、酒精度的變?/p>

由圖6可知，菌株S017和F076發(fā)酵甜橙果酒的酒精度和殘余總糖含量變化趨勢(shì)相同。在發(fā)酵前期兩株菌株發(fā)酵果酒酒精度增長速率相近，后期S017的酒精度高于F076，說明兩者起酵速率相近，但F076的產(chǎn)酒精能力不及S017。發(fā)酵結(jié)束時(shí)F076的總糖含量高于S017，糖的利用率不及S017。

圖 6 發(fā)酵過程中總糖和酒精度的變化Fig.6 Changes in alcohol content and total sugar during fermentation

2.5 不同酵母對(duì)發(fā)酵甜橙果酒品質(zhì)的影響

2.5.1 不同酵母發(fā)酵甜橙酒理化指標(biāo)

表 4 不同酵母發(fā)酵甜橙酒理化指標(biāo)Table 4 Physico-chemical indexes of sweet orange wine fermented by different yeast strains

由表4可知，S017所發(fā)酵的甜橙果酒理化指標(biāo)與對(duì)照果酒干酵母發(fā)酵的甜橙果酒差異不大。F076發(fā)酵的果酒中殘余總糖含量高于其他酒樣，糖的利用率不及其他菌株，酒精度略低于其他酒樣，總酸和pH值與其他酒樣差異不大。

2.5.2 不同酵母發(fā)酵甜橙酒的感官指標(biāo)

表 5 甜橙酒感官評(píng)定結(jié)果Table 5 Sensory evaluation of sweet orange wine

由表5可知，篩選酵母發(fā)酵的甜橙果酒在色澤和透明度方面與對(duì)照發(fā)酵甜橙酒差異不大，但在香氣、口感及典型性方面明顯優(yōu)于對(duì)照。3個(gè)酒樣中以S017所發(fā)酵果酒香味最為濃郁，綜合風(fēng)味最佳。

2.5.3 不同酵母發(fā)酵甜橙酒香氣成分

果酒的香味取決于含有香味的化合物的種類及含量，由表6可知，3個(gè)酒樣共檢出香氣組分73種，其中酯類49種、醇類9種、酸類2種、萜類7種、醛類4種、其他2種，菌株F076、S017及果酒干酵母發(fā)酵的酒樣的香氣物質(zhì)種類依次為38、42、31種。不同酵母發(fā)酵果酒香氣物質(zhì)組成差異較大，其中共有的物質(zhì)有8種，分別為己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醇、α-松油醇、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚，但這些共有的香氣物質(zhì)在3個(gè)酒樣中的相對(duì)含量差別大。酯類是果酒中含量最多、最主要的風(fēng)味組分，F(xiàn)076、S017所發(fā)酵的果酒酯類物質(zhì)種類和含量均比干酵母所發(fā)酵的甜橙果酒高，篩選酵母產(chǎn)酯能力強(qiáng)于果酒干酵母。Selli等[20]曾指出己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、香茅醇、苯乙醇和丁香酚是橙酒香氣貢獻(xiàn)最大的幾種物質(zhì)，酒樣F076和干酵母酒樣中未檢測(cè)到香茅醇和丁香酚，酒樣S017中未檢測(cè)到芳樟醇和丁香酚，己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇在3個(gè)酒樣中均被檢出，但含量差異較大，其中酒樣S017中含量最高。

表 6 不同酵母發(fā)酵甜橙酒香氣組分Table 6 Aroma compositions of sweet orange wine fermented by different yeast strains

續(xù)表6

3 結(jié) 論

本研究通過對(duì)甜橙果皮和果園土壤中酵母菌株的篩選，得到兩株優(yōu)良甜橙果酒酵母S017和F076，經(jīng)鑒定S017和F076為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)的不同菌株。兩株菌株耐酒精大于15%，能耐受150mg/L SO2，均能滿足生產(chǎn)需要。S017的最適發(fā)酵溫度24℃，最適發(fā)酵pH值為5.0，F(xiàn)076的最適發(fā)酵溫度30℃，最適pH值為5.5，S017較F076具有更好的低溫發(fā)酵能力和耐低pH值的能力。S017產(chǎn)酒力和糖的轉(zhuǎn)化率大于F076。篩選的菌株所發(fā)酵的果酒在口感、香氣和典型性方面均優(yōu)于活性干酵母所發(fā)酵的果酒，在香氣成分方面，S017所發(fā)酵果酒的香氣成分種類多于其他酒樣，且橙酒特征香氣物質(zhì)己酸乙酯、辛酸乙酯和苯乙醇相對(duì)含量遠(yuǎn)高于其他酒樣。綜合各項(xiàng)性能表明，菌株S017較菌株F076和果酒干酵母更適合甜橙果酒的釀造。

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