史艷宇，劉金華 ，薛力剛，邴 煒，華 蕾，趙立群，周 亮，劉曉暉，王 瀟，張慶波，冷喜芳

(1.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長春 130022；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130018)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是一種人畜共患病病原菌，可以引起人和動物發(fā)生多種疾病，同時(shí)也是一種食物源性病原菌，被認(rèn)為是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要病菌。在發(fā)展中國家，空腸彎曲菌是兒童腹瀉死亡的重要病原，也是導(dǎo)致發(fā)展中國家旅行者腹瀉的最常見病原，由其引起的最嚴(yán)重的并發(fā)癥是格林-巴利綜合癥，這是外周神經(jīng)系統(tǒng)的急性脫髓鞘疾病[1]。由于空腸彎曲菌與人類常見病密切相關(guān)，且在人群中感染率高，因而受到重視。

近年來，國內(nèi)外已發(fā)展出多種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)的食源性致病菌快速檢測方法，如多重PCR[2-4]、實(shí)時(shí)PCR[5]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-酶聯(lián)免疫吸附分析法(polymerase chain reaction-enzyme linked immuno sorbent assay，PCR-ELISA)[6]等。應(yīng)用多重PCR可以同時(shí)擴(kuò)增出一條以上的目的DNA片段，適于多種病原微生物的同時(shí)檢測，但特異性較低，敏感性較差。實(shí)時(shí)熒光PCR可實(shí)現(xiàn)定量檢測，但需要特殊的設(shè)備和探針，成本較高。而PCR-ELISA法簡便經(jīng)濟(jì)，只要具備PCR儀和酶標(biāo)儀即可進(jìn)行，具有較高的特異性和敏感性，適于大量樣品篩選[7-9]。目前，在我國利用PCRELISA方法對空腸彎曲菌檢驗(yàn)還處于空白水平，因此，研究食品中空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測鑒定方法具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空腸彎曲菌(Campylobacter Jejuni，ATCC 33291)；大腸埃希氏菌(Escherichia coli，CICC 10032)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CGMCC 1.1361)；單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC 15313)；鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium，CGMCC 1.1194)；產(chǎn)氣夾膜梭菌(Clostridium perfringens，CICC 22949)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，ATCC 17803)；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，CGMCC 1.1129)；痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae CGMCC 1.1869)等。

細(xì)菌基因組小量提取試劑盒、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP(各10mmol/L)、10×buffer 緩沖液、6×Loading Buffer、100bp DNA Ladder Marker、PCR引物及探針 寶生物工程(大連)有限公司；Bolton肉湯(BHIB，根據(jù)產(chǎn)品說明書配制) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；彎曲桿菌瓊脂基礎(chǔ)和彎曲桿菌選擇培養(yǎng)添加劑 德國Merck公司；API Campy 試劑盒 生物梅里埃中國有限公司；DIG DNA Labeling Mix、抗地高辛過氧化物酶、ABST tablets、ABST buffer 德國羅氏公司；鏈霉親和素 美國Amresco公司；牛血清白蛋白(BSA) 美國Sigma-Aldrich公司。

PBST緩沖液(pH7.4)：氯化鈉8.0g、磷酸二氫鉀0.2g、十二水磷酸氫二鈉2.9g、氯化鉀0.2g、吐溫-20 0.5mL，加去離子水定容至1L。包被液(pH9.8)：Na2CO31.6g、NaHCO32.9g、NaN30.2g、蒸餾水加至1L，高壓滅菌。變性液：0.1mol/L NaOH、0.3mol/L NaCl溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；Synergy HT多功能微孔板檢測儀 美國BioTek公司；超凈工作臺 蘇州安泰有限公司；M20食物研磨器 德國IKA公司；Tgradient-96 PCR擴(kuò)增儀 德國Biometra公司；BioSpecmini型DNA/RNA/蛋白分析儀 日本島津公司；EC250-90型電泳儀 美國安捷倫公司；EDAS290凝膠成像系統(tǒng) 美國柯達(dá)公司；生化恒溫培養(yǎng)箱(德國BINDER)；0.1～1000μL微量移液器 法國Jilson公司；Anaerocult C微需氧產(chǎn)氣包 德國Merck公司；微需氧罐 日本三洋公司；96孔高吸附力平底酶標(biāo)板 丹麥Nunc公司。

1.3 方法

1.3.1 空腸彎曲菌的培養(yǎng)

取空腸彎曲菌凍干粉接種于Bolton肉湯中，于微需氧條件下42℃培養(yǎng)24～48h，取1mL增菌液提取DNA用于PCR-ELISA檢測。將增菌液接種于空腸彎曲菌選擇培養(yǎng)基上，接種后的分離平板置于加有微需氧產(chǎn)氣包的微需氧罐中42℃培養(yǎng)18～48h，觀察菌落特征，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行分純培養(yǎng)，純化后的典型菌落用API Campy試劑盒鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.3.2 DNA的提取

取空腸彎曲菌增菌液，按細(xì)菌基因組小量提取試劑盒說明書的方法進(jìn)行DNA提取。用DNA分析儀檢測其純度及質(zhì)量濃度。

1.3.3 空腸彎曲菌引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的空腸彎曲菌部分16S rRNA序列(L04315)中的保守片段，采用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)特異引物及探針：C16S-F：5’-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’(449～468)，捕獲探針5’-AGA CTG CCA TGG ATT CCT TA-3’，5’端標(biāo)記生物素。擴(kuò)增片段大小為287bp。

1.3.4 PCR反應(yīng)與電泳檢測

PCR反應(yīng)體系(總體積25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP(各10mmol/L) 2μL，Ex Taq DNA酶 (5U/μL) 0.5μL，DNA模板2μL，引物(25μmol/L))各2μL，ddH2O 補(bǔ)足體積到25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸4min。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，90V電壓電泳40min，分析電泳結(jié)果。

1.3.5 地高辛標(biāo)記反應(yīng)

總體積50μL，反應(yīng)組成為：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，10mmol/L DIG Labeling Mix 2μL，25μmol/L正反向引物各2μL，5U/μL Taq酶1μL，模板DNA 4μL，滅菌超純水30μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，35個(gè)循環(huán)后再72℃徹底延伸4min。

1.3.6 標(biāo)記DIG探針的檢測

將含有10mg/L鏈霉親和素的包被液以200μL/孔加入微孔板，4℃在濕盒中包被過夜。取出后棄去液體，每孔加250μL的0.05% PBST緩沖液，洗滌3次，每次浸泡2～3min，每次均需甩干。再將含3%BSA的封閉液以250μL/孔加入微孔板，于37℃溫育1h。取出后，甩去液體，每孔加250μL的0.05% PBST緩沖液，洗滌3次，每次浸泡2～3min，每次均需甩干。20～40μL變性液中加5～10μL地高辛標(biāo)記的產(chǎn)物，混勻，至室溫(15～25℃)10min，再加入200μL生物素標(biāo)記的探針(10pmol/L)，混勻。每孔加入200μL上述雜交反應(yīng)液。55℃溫育2h。每孔加200μL PBST緩沖液，洗滌3次，每次浸泡2～3min，每次均需甩干。每孔加200μL 100倍稀釋的抗地高辛過氧化物酶，37℃反應(yīng)30min。每孔加200μL PBST緩沖液，洗滌3次，每次浸泡2～3min，每次均需甩干。每孔加入200μL ABST底物顯色液。37℃，避光顯色30min。酶標(biāo)儀讀取OD405nm值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性對照，陰性對照和空白對照。以空白對照的OD405nm平均值做為本底值，其余樣品的OD405nm值均取其平均值減去本底值。

1.3.7 特異性試驗(yàn)

分別用單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌等食品中常見致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.3.8 靈敏度試驗(yàn)

取地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，用雙蒸水做10倍倍比稀釋，分別取5μL進(jìn)行ELISA檢測，設(shè)陰性對照和空白對照，每個(gè)樣品設(shè)3組重復(fù)。同時(shí)將各稀釋度樣品分別取5μL進(jìn)行電泳檢測，觀察二者間敏感性差異。

1.3.9 結(jié)果判定[6,10]

實(shí)驗(yàn)中設(shè)有陽性和陰性對照，每份樣品都設(shè)置3組平行孔，取三孔平均值減去本底值為該樣品的吸光度。對于陰性對照，吸光度應(yīng)該低于0.25，如果吸光度高于此值，則包括PCR反應(yīng)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)必須重做。對于陽性對照，吸光度應(yīng)該高于1.2，如果吸光度低于此值，則包括PCR反應(yīng)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)也必須重做。對于檢測的樣本，其吸光度和陰性對照吸光度之差高于0.2則可認(rèn)為是陽性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 空腸彎曲菌基因的特異性驗(yàn)證

在優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，以單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌等的DNA為特異性對照，進(jìn)行PCR檢測。電泳結(jié)果顯示，僅有空腸彎曲菌有擴(kuò)增條帶，而其他對照以及陰性對照均無擴(kuò)增條帶(圖1)。

圖 1 空腸彎曲菌PCR檢測方法的特異性Fig.1 Specificity of PCR detection for Campylobacter jejuni

2.2 PCR-ELISA的特異性檢測

以空腸彎曲菌為陽性對照，以單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌等為陰性對照，以滅菌超純水為空白對照，進(jìn)行PCRELISA檢測。結(jié)果表明，只有空腸彎曲菌檢測結(jié)果為陽性，其余結(jié)果均為陰性。結(jié)果見表1。

表 1 PCR-ELISA特異性檢測結(jié)果Table 1 PCR-ELISA specificity

2.3 PCR-ELISA檢測的敏感性

取產(chǎn)物原液及各稀釋度產(chǎn)物5μL，對每一基因組進(jìn)行檢測，PCR-ELISA檢測敏感性可達(dá)10-3(即1000倍稀釋產(chǎn)物)。PCR-ELISA與電泳檢測相比較的結(jié)果見表2和圖2。

表 2 PCR-ELISA敏感性結(jié)果Table 2 PCR-ELISA sensitivity

圖 2 PCR敏感性檢測結(jié)果Fig.2 PCR sensitivity

2.4 PCR-ELISA檢測方法的應(yīng)用

表 3 PCR-ELISA與生化鑒定的結(jié)果Table 3 Comparison between PCR-ELISA and API biochemical identification

對空腸彎曲菌人工污染的30份牛奶樣品，60份雞肉樣品進(jìn)行空腸彎曲菌分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)后，經(jīng)API生化鑒定和PCR-ELISA方法檢測，其檢出率與API生化鑒定檢出率一致。

3 結(jié)論與討論

空腸彎曲菌對體外生長條件要求苛刻，培養(yǎng)困難，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式對于快速準(zhǔn)確進(jìn)行檢測與鑒定有一定難度[11]。因此如何快速檢驗(yàn)這些食品中的空腸彎曲茵，保證人民食品安全，是一個(gè)重要課題。本實(shí)驗(yàn)建立的PCR-ELISA檢測技術(shù)，是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型DNA檢測方法，可用于定量檢測。它綜合了PCR，分子雜交和ELISA 3種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、不需要電泳和純化PCR產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，全過程只需5～6h，能滿足檢測部門快速、準(zhǔn)確檢測樣品的工作需求，適合相關(guān)部門進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)基因樣品的快速篩選和鑒定[12-15]。

本研究根據(jù)空腸彎曲菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物及探針，成功建立了食品中空腸彎曲菌的PCR-ELISA檢測方法，填補(bǔ)了食品中空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)的空白。與以往相關(guān)研究方法比較，本研究方法具有快速、靈敏(較普通PCR法高10倍)、特異的特點(diǎn)。本研究中所采用方法可應(yīng)用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)控及出口食品的病原微生物檢測等各個(gè)領(lǐng)域，可以為食品致病菌檢測提供技術(shù)支持，同時(shí)為建立食品中致病菌新的快速篩選檢測打下良好基礎(chǔ)。

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