柳昌武，陳曉光，韋藤幼*，童張法

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西石化資源加工及過程強(qiáng)化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

辣椒堿(capsaicin)化學(xué)名為[(4-羥基-3-甲氧基苯基)-甲基]-8-甲基-(反)-6-壬烯酰胺，是辣椒中引起辛辣味的主要物質(zhì)[1]。研究表明辣椒堿具有鎮(zhèn)痛、消炎、治療凍傷、止癢、殺菌、戒毒、祛風(fēng)濕、殺蟲、催淚等[[2-5]藥理作用。目前對辣椒堿提取工藝的研究已有較多報(bào)道，主要有溶劑回流萃取法[6-10]、超聲波[11]及微波[12]輔助提取法、超臨界CO2流體萃取法[13-14]、酶法[15]，傳統(tǒng)的溶劑回流萃取法存在溶劑消耗大、提取得率低及雜質(zhì)含量高等缺點(diǎn)，而其他的提取方法都需要昂貴的設(shè)備及較高的操作成本。

內(nèi)部沸騰法[16-18]是一種能實(shí)現(xiàn)低溫快速的強(qiáng)化植物有效成分提取方法，它具有收率高、產(chǎn)品雜質(zhì)少及容易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，與其他提取工藝相比，該法在提取效率及提取質(zhì)量方面具有優(yōu)越性[19-20]。然而，內(nèi)部沸騰法提取工藝中影響提取得率的因素較多，一些因素交叉作用明顯，利用單因素來研究因素對提取過程的影響，往往得不到最優(yōu)的工藝條件[21]。本實(shí)驗(yàn)以減壓內(nèi)部沸騰法提取辣椒堿為研究對象，首先采用部分析因設(shè)計(jì)進(jìn)行因素篩選，然后對選定的因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)確定最優(yōu)點(diǎn)范圍，最后在最優(yōu)點(diǎn)范圍內(nèi)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定了減壓內(nèi)部沸騰法提取最佳工藝條件，為實(shí)現(xiàn)辣椒堿的綠色提取提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮指天椒(產(chǎn)于廣西橫縣，乙醇回流法重復(fù)提取3次測定辣椒堿含量為0.271%)，50℃真空干燥后粉碎至80目；辣椒堿對照品(含量≥99%) 上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；D101大孔吸附樹脂 南開大學(xué)化工廠；乙醇(分析純) 廣東汕頭市西隴化工廠；甲醇(色譜純) 天津四友化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CBM-10A vp島津-高效液相色譜儀(配有SPD-10AVP Plus紫外-可見檢測器和島津LC色譜工作站) 日本島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SZM 45-T2體視顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

減壓內(nèi)部沸騰法：稱取10g辣椒粉，加入一定體積的較高體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液(解吸劑)均勻潤濕30min，使乙醇溶液充分浸潤辣椒物料；在一定溫度下，加入一定體積的較低體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液(提取劑)并迅速減壓，提取5min；過濾，取少量濾液，HPLC測定辣椒堿的含量，剩余濾液冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)裝置見圖1。

圖 1 實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.1 Schematic diagram of vaccum innner ebullition extraciton

乙醇回流法：稱取10g辣椒粉，加入120mL質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，加熱回流1h，過濾；取少量濾液，HPLC測定辣椒堿的含量，剩余濾液冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 純化工藝

分別稱取10g(干質(zhì)量約2g)D101大孔吸附樹脂，采用濕法裝入層析柱中。將減壓內(nèi)部沸騰法及乙醇回流提取法制備的辣椒堿提取液減壓濃縮，濃縮物用蒸餾水稀釋至200mL，1mL/min上柱；上柱結(jié)束后，用50%乙醇洗至流出液無色，然后采用70%乙醇溶液洗脫至解吸液無辣味，收集70%乙醇解吸液，減壓濃縮并干燥；干燥物用甲醇溶解并定容至50mL，HPLC測定辣椒堿的含量。

1.3.3 顯微鏡掃描

取不同提取工藝的濾渣，50℃真空干燥、粉碎后，平鋪于載玻片上，用顯微鏡(放大20～30倍)進(jìn)行放大掃描，記錄照片。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18Hypersil ODS色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：甲醇：0.1%磷酸＝65：35 (V/V)；檢測波長：λ＝280nm；流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫。

1.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取真空干燥后的標(biāo)準(zhǔn)品辣椒堿2.30mg，溶解后轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中并用甲醇定容至刻度，制得9.11mg/L辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取1、5、10、15、20μL進(jìn)樣，HPLC測定峰面積，以辣椒堿質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：Y＝19065.6X－0.37594(R2＝0.9998)，線性范圍：0.46～9.11mg/L。

1.4.3 辣椒堿提取得率測定

辣椒堿提取得率按式(1)計(jì)算：

式中：y為辣椒堿提取得率/%；N為稀釋倍數(shù)；c為辣椒堿質(zhì)量濃度/(mg/L)；V為提取液體積/mL；m為辣椒粉質(zhì)量/g。

1.5 提取工藝條件的優(yōu)化

1.5.1 因素篩選試驗(yàn)

減壓內(nèi)部沸騰提取過程分兩步，第一步的解吸劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)(X1)和解吸劑用量(X2)和第二步的提取劑(低體積分?jǐn)?shù)乙醇)體積分?jǐn)?shù)(X3)、提取劑用量(X4)以及提取溫度(X5)等因素對減壓內(nèi)部沸騰提取過程有影響，但那些因素影響大需確定。采用2Ⅴ5-1析因設(shè)計(jì)對X1～X5這5個(gè)因素進(jìn)行篩選。因素水平編碼及試驗(yàn)方案見表1。

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面法優(yōu)化必須在最優(yōu)點(diǎn)的附近區(qū)域模擬真實(shí)情形，遠(yuǎn)離最優(yōu)點(diǎn)區(qū)域擬合的模型可靠性低[14]。為了獲得最佳的提取條件范圍，本實(shí)驗(yàn)采用最陡爬坡試驗(yàn)對影響較大條件進(jìn)行逼近。具體步驟如下：首先，對2Ⅴ5–1析因設(shè)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行一階模型擬合，如式(2)所示，篩選出影響較大因素；其次，取│βj│最大時(shí)對應(yīng)的變量Xj的步長為Δxj，按式(3)計(jì)算其他變量的步長；將Δxi按式(4)轉(zhuǎn)換成自然變量步長Δξi。取各顯著因素的0水平為原點(diǎn)，以βi的符號正負(fù)為爬坡方向設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)。試驗(yàn)方案見表2。

式中：y為提取得率；β0、βi為歸系數(shù)；Xi為試驗(yàn)因素。

式中：Xi(1)、Xi(–1)分別為i因素的低水平與高水平。

1.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化

以最陡爬坡試驗(yàn)中提取得率最高的試驗(yàn)條件作為中心點(diǎn)，進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)，共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)：前14個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)為析因點(diǎn)，即自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；后6個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，重復(fù)6次用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。因素水平編碼和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表3。

運(yùn)用Design-Export 7.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合得回歸模型見式(5)，對回歸模型進(jìn)行分析并計(jì)算辣椒堿的最大提取得率及相應(yīng)的最優(yōu)提取工藝條件，最后對最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

式中：y為提取得率；β0、βi、βii、βij為歸系數(shù)；Xi為試驗(yàn)因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 因素篩選試驗(yàn)

表 1 2V5–1析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及結(jié)果Table 1 Experimental arrangements and results of 2V5–1 factorial design

通常而言，因素影響的顯著性可以由回歸t檢驗(yàn)的P值大小來判定。表1數(shù)據(jù)的回歸分析見式(6)，t檢驗(yàn)可知因素X4(P4＝0.0666)及X5(P5＝0.2192)對響應(yīng)值的影響不顯著(P＞0.05)，確定提取用量為12mL/g，提取溫度為50℃，而因素X1、X2及X3對響應(yīng)值的影響高度顯著，需對它們進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。不難看出，提取得率最高的條件在第2組與第4組試驗(yàn)之間，第3組試驗(yàn)的提取得率最高，所以選取第3組試驗(yàn)條件為響應(yīng)面優(yōu)化的中心點(diǎn)，并以第2組與第4組試驗(yàn)條件為邊界條件，進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)。

表 2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the steepest ascent experiment

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

表 3 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 3 Experimental design and results of the central composite design experiments

表3給出了提取工藝的中心復(fù)合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果，采用式(5)的模型對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行次初步回歸見式(7)，對回歸進(jìn)行t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，X1X2、X1X3和X12的影響不顯著(P＞0.05)，去掉這3項(xiàng)的回歸結(jié)果見式(8)。

由式(8)知：①X1、X2、X3的系數(shù)大小順序?yàn)棣?＜ β2＜β3，所以，X1、X2、X3對響應(yīng)值影響顯著性大小為：提取劑體積分?jǐn)?shù)＞解吸劑用量＞解吸劑體積分?jǐn)?shù)。②X2和X3具有交互作用，圖2給出了X2、X3因素間交互作用對辣椒堿提取得率的影響，由圖可知X2、X3的交互作用對辣椒堿的提取得率影響存在最大值。

通過對式(8)進(jìn)行最優(yōu)化計(jì)算得：最高提取得率y＝0.212%，此時(shí)：X1＝－0.945、X2＝1.601、X3＝0.624；對應(yīng)最佳工藝條件：解吸劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為82%，解吸劑用量為3.5mL/g物料，提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)44%。按照最佳工藝條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其提取得率分別為0.213%、0.211%、0.208%，平均提取得率為0.211%(σ＝0.0025)，與預(yù)測值基本一致，說明回歸模型可靠。

圖 2 解吸劑用量與提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)因素間交互作用對提取得率影響的響應(yīng)曲面圖與等高線圖Fig.2 Response surfaces and contour plot of the interaction between each factors on the yield of capsaicin

2.4 辣椒堿的減壓內(nèi)部沸騰法提取與乙醇回流法提取的對比

對優(yōu)化后的減壓內(nèi)部沸騰法提取液和乙醇回流法提取液用D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，純化結(jié)果及主要工藝參數(shù)的對比見表4。由表可知，雖然減壓內(nèi)部沸騰法的提取得率比乙醇回流法提高不多(一次提取辣椒堿提取率為77.9%)，但提取時(shí)間、溫度、乙醇用量以及純化后的過柱浸膏收率與純度都有明顯優(yōu)勢，特別是提取液過柱收率提高了15.8%及浸膏純度提高了5.0%，這是因?yàn)闇p壓內(nèi)部沸騰法提取溫度低、乙醇體積分?jǐn)?shù)低以及時(shí)間短，辣椒的色素等雜質(zhì)提出少，對大孔吸附樹脂的污染較輕，這樣提高了純化的分離效果。圖3所示的提取前辣椒粉及兩種方法提取后辣椒殘?jiān)娘@微照片也同樣說明了這個(gè)問題，減壓內(nèi)部沸騰法提取后的辣椒殘?jiān)c提取前的辣椒粉形貌與顏色差別不大，而傳統(tǒng)回流法的提取殘?jiān)珴杉由睢⒏癄€結(jié)團(tuán)，顆粒膨脹及溶化較嚴(yán)重。所以減壓內(nèi)部沸騰法提取的辣椒粉殘?jiān)?jīng)烘干、粉碎等簡單處理即可以作為低辣度的辣椒粉應(yīng)用于食品調(diào)料、飼料添加劑以及作為制備微辣辣椒油的原料。

表 4 減壓內(nèi)部沸騰法與乙醇回流法對辣椒堿的提取及純化工藝的比較Table 4 Comparison between the tradition ethanol refluxing extraction and the inner ebullition extraction

圖 3 原辣椒粉與提取殘?jiān)膶Ρ菷ig.3 Comparison between cayenne peppers before and after extraction

3 結(jié) 論

減壓內(nèi)部沸騰提取法的主要影響因素為解吸劑體積分?jǐn)?shù)、解吸劑用量、提取劑體積分?jǐn)?shù)，辣椒堿的減壓內(nèi)部沸騰法提取工藝最佳條件為解吸劑乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、解吸劑用量3.5mL/g、提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)44%、提取劑用量12mL/g，此條件下50℃提取5min，辣椒堿的提取得率為0.211%。

與乙醇回流法的對比表明，減壓內(nèi)部沸騰法具有提取時(shí)間短、溫度低及提取質(zhì)量好等優(yōu)越性，提取后的殘?jiān)c提取前的外觀差別不大，可以作為制備微辣辣椒食品的原料。

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