宋相波

(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠 浙江紹興 312500)

β－胡蘿卜素,被FAO和WHO食品添加劑協(xié)會一致推薦并認定為A類營養(yǎng)色素,是一種有效的生物抗氧化劑,近年來,它的應用領域從食品著色轉向營養(yǎng)食品、保健品、藥品及飼料四大領域,市場需求不斷增加。

β－胡蘿卜素的生產方法有化學合成,植物提取和微生物發(fā)酵三種。微生物發(fā)酵法生產天然β－胡蘿卜素因不受環(huán)境條件限制而受到重視,是現(xiàn)在國際上工業(yè)化生產β－胡蘿卜素的主要研究方向。目前已發(fā)現(xiàn)能合成β－胡蘿卜素的微生物主要有瑞士乳桿菌、球形紅桿菌、短桿菌、分枝桿菌、粘紅酵母、布拉克須霉、三孢布拉霉等。尤其三孢布拉霉(Blakeslea trispora)與其他菌種相比具有生物量大,單位菌體量β－胡蘿卜素產量高等優(yōu)點,是工業(yè)化生產天然β－胡蘿卜素的理想微生物[1]。為進一步提高此菌株的合成能力,本文通過在不同時期添加β－胡蘿卜素結構類似物三孢酸、β-紫羅蘭酮、巴比妥酸,考察其對合成β－胡蘿卜素是否有促進作用[2]。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌株

三孢布拉霉菌“＋”“－”菌株,筆者實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基[3](新鮮去皮馬鈴薯200g,蔗糖20g,瓊脂20g加水至1000ml,PH自然)。

母瓶培養(yǎng)基:玉米漿6%,葡萄糖2%,玉米粉1%,KH2PO40.005%,VB10.0002%,豆油1%。PH調至6.5

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉2%,黃豆粉2%,玉米漿3%,豆油4%,KH2PO40.005%,VB10.0002%,Mg2SO40.025%。PH調至7.0。

1.3 培養(yǎng)條件

將保藏菌株三孢布拉霉菌“＋“－”菌株分別涂布于PDA斜面,28℃培養(yǎng)3—5天,“＋”“－”菌孢子分別用無菌水洗下。接入裝量為160ml的750ml三角瓶中,在溫度為28.0℃,搖床轉速為230r/min條件下培養(yǎng)48小時?！埃薄埃本砸欢恳欢ū壤尤胙b量為30ml的250ml三角瓶中,在溫度為28.0℃,搖床轉速為230r/min條件下培養(yǎng)6天。

1.4 補料方案

A方案:以1.3培養(yǎng)條件進行培養(yǎng),分別在發(fā)酵培養(yǎng)階段0hr,24hr,48hr添加三孢酸0.01%,0.05%,0.1%,培養(yǎng)結束后檢測β－胡蘿卜素含量。

B方案:以1.3培養(yǎng)條件進行培養(yǎng),分別在發(fā)酵培養(yǎng)階段0hr,24hr,48hr添加β-紫羅蘭酮0.01%,0.05%,0.1%。培養(yǎng)結束后檢測β－胡蘿卜素含量。

表1

C方案:以1.3培養(yǎng)條件進行培養(yǎng),分別在發(fā)酵培養(yǎng)階段0hr,24hr,48hr添加巴比妥酸0.01%,0.05%,0.1%,培養(yǎng)結束后檢測β－胡蘿卜素含量。

對照方案:按1.3培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng),不進行任何補料。

1.5 檢測方法

樣品處理后,在波長為455nm可光分光光度計下測得其含量(ug/ml)。

2 結果與分析

對按A,B,C方案及對照方案培養(yǎng)的最終產物含量檢測結果(單位ug/ml)如表1。

從結果分析,在培養(yǎng)開始就加入結構類似物三孢酸、β-紫羅蘭酮、巴比妥酸,反而減少了最終產物β－胡蘿卜素的合成,原因在于初期加入類似物質,對菌絲生長存在一定的毒副作用,降低了的生長菌絲的質量,從而影響了初級代謝[4]。24hr補料及48hr補料對最終產物的合成基本都有促進的作用(除24hr添加0.1%β-紫羅蘭酮和24hr添加0.1%巴比妥酸外),原因可能為24hr以后,菌絲已經達到一定濃度,且已向初級代謝轉化,添加類似物質提高了產物合成中多功能氧化酶的活性,使初級代謝提前加速。而在同濃度下,24hr補料產物合成量明顯比48小時補料的要高很多,主要原因由于48hr時,菌體自身產生的氧化酶活性已經使產物β－胡蘿卜素的轉化接近飽和,添加類似物質提高氧化酶活性的作用已減弱,促進產物合成的作用已不再明顯。

在菌絲生長到一定程度后,三種物質一定比例的補料對β－胡蘿卜素的合成都具有促進作用,但其中尤以巴比妥酸補料的效果最為明顯。作為β－胡蘿卜素的結構類似物,巴比妥酸不僅能提高產物合成中多功能氧化酶的活性,可能還作為一種底物,直接參與了β－胡蘿卜素的合成,從而增加了最終產物量。但過度添加巴比妥酸反而呈現(xiàn)負反饋作用,從結果上分析,巴比妥酸添加比例應小于0.05%.

3 結語

通過對三孢布拉霉菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中不同時期,不同比例的補料結果分析,補充類似物質對三孢布拉霉菌合成β－胡蘿卜素是有具有促進作用的,但補料時間應選在菌絲已生長到一定程度后,初級代謝啟動初期。類似物中以巴比妥酸的補料效果最佳,在發(fā)酵培養(yǎng)24hr,添加0.01%的巴比妥酸,使最終產物的含量比普通培養(yǎng)高出19.5%.

[1]工業(yè)微生物,2002;32(4):7～10.

[2]王見冬,袁其朋,錢忠明.β－胡蘿卜素發(fā)酵過程中關鍵的代謝產物—三孢酸* 微生物學通報,2004年31(3):147～150.

[3]食品與發(fā)酵為業(yè),2003;29(7):69～74.

[4] 白秀峰.微生物藥物工藝學講義,102～106.