吳永超 楊國(guó)有 唐朝暉 張華 楊金亮 秦敏*

(1.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川成都 610041;2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗一室 四川成都 610023)

破傷風(fēng)(Tetanus)是由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌的感染引起的嚴(yán)重感染性疾病,在發(fā)展中國(guó)家仍是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,一般估計(jì)每年死于破傷風(fēng)的人數(shù)約為100萬(wàn),其中約80%為新生兒。早在19～20世紀(jì),已證明破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素引起的,并獲得了用毒素脫毒制成類毒素預(yù)防破傷風(fēng)的有效方法。破傷風(fēng)類毒素制劑主要有破傷風(fēng)疫苗、白喉破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗以及百日咳-白喉-破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗。我國(guó)主要采用無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗(DTaP)對(duì)兒童進(jìn)行計(jì)劃免疫,100%的被免疫者可達(dá)到保護(hù)水平以上,且10-15年仍有80%的人群其抗體仍在保護(hù)水平之上[1][2]。破傷風(fēng)類毒素也常作為蛋白載體用于結(jié)合疫苗,如b型流感嗜血桿菌-破傷風(fēng)類毒素(Hib-TT)結(jié)合疫苗,14型肺炎球菌莢膜多糖－破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗等。

圖1 Vmax 恒壓試驗(yàn)示意圖Fig 1 Schematic diagram of Vmax

圖2 Pmax 恒流試驗(yàn)示意圖Fig 2 Schematic diagram of Pmax

破傷風(fēng)類毒素制備采用破傷風(fēng)桿菌于液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵液澄清過(guò)濾去除菌體后超濾濃縮,再經(jīng)純化后甲醛脫毒制成類毒素。澄清過(guò)濾從最初的帆布過(guò)濾,過(guò)渡到板框?yàn)V器過(guò)濾。板框?yàn)V器采用EKS濾板過(guò)濾,為半開(kāi)放式,EKS濾板的吸附損失較大,過(guò)濾時(shí)常常需要更換濾板,對(duì)制品和環(huán)境都存在較大的安全風(fēng)險(xiǎn)。為符合GMP要求,本文選用表面濾器P olyse p II C GW3(1.0/0.2um)和深層濾器Millistak+X0HC(0.2um)兩種密閉式濾器進(jìn)行破傷風(fēng)桿菌發(fā)酵液澄清過(guò)濾對(duì)比試驗(yàn),考察兩種濾器的澄清效果和對(duì)破傷風(fēng)毒素的吸附情況,并對(duì)實(shí)際工藝所需的膜面積進(jìn)行推算,篩選合適的濾器類型,選擇出一種安全經(jīng)濟(jì)高效的過(guò)濾器。

圖3 Polysep II CGW3 Vmax 試驗(yàn)曲線Figure 3 the curves of Polysep II CGW3 Vmax test

圖4 Millistak+ X0HC Pmax 曲線Figure 4 the curve of Millistak+ X0HC Pmax

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

1.2 主要試劑及儀器

破傷風(fēng)抗毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;表面濾器Polysep II CGW3面積13.8 cm2,深層濾器Millist ak+X0HC面積26cm2,均由Merck millipore公司提供;JY10001電子天平為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;Micro 950濁度儀為英國(guó)百靈達(dá)有限公司產(chǎn)品;BT100-2J恒流泵為保定蘭格恒流泵有限公司產(chǎn)品。

1.3 Vmax試驗(yàn)

Vmax試驗(yàn)即恒壓試驗(yàn),即在恒定壓力下使料液通過(guò)過(guò)濾器,并在一定時(shí)間間隔記錄濾液體積, 其基本原理是依據(jù)濾膜逐漸堵塞模型方程,通過(guò)計(jì)算可預(yù)知濾器的最大負(fù)載和流量衰減,從而進(jìn)行過(guò)濾器的選型放大[4],適用于Polysep II CGW3(1.0/0.2um)表面濾器。

按(圖1)所示安裝系統(tǒng),準(zhǔn)備約2 L料液,設(shè)定過(guò)濾壓力恒為10psi,當(dāng)?shù)谝坏瘟弦哼M(jìn)入收集容器時(shí)開(kāi)始秒表計(jì)時(shí),持續(xù)約10分鐘,在適當(dāng)時(shí)間間隔測(cè)定濾液體積(測(cè)定重量轉(zhuǎn)換)及毒素絮狀單位,并對(duì)濾液的濁度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)計(jì)算出Polysep II CGW3(1.0/0.2um)表面濾器的通量,載量,T/V等。

1.4 Pmax 試驗(yàn)

Pmax試驗(yàn)即恒定流速試驗(yàn),以恒定的流速使料液通過(guò)濾器,記錄一定時(shí)間間隔的過(guò)濾器壓降和濾液體積,當(dāng)濾器的壓降達(dá)到設(shè)定值(基本完全堵塞的壓力值)時(shí)停止試驗(yàn)。對(duì)于以吸附為主要截留方式的過(guò)濾,以濁度的貫穿(吸附位點(diǎn)基本飽和)作為試驗(yàn)終止的依據(jù)。深層過(guò)濾不符合逐漸堵塞模型,不適用于Vmax試驗(yàn),故Millistak+X0HC深層濾器采用Pmax試驗(yàn)。

按(圖2)所示安裝系統(tǒng),設(shè)定恒定流速為12ml/min(通量為281.4LMH),記錄一定時(shí)間間隔的過(guò)濾器壓降和濾液體積及毒素絮狀單位,試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)測(cè)量濾液濁度,當(dāng)濁度貫穿(比初始值高40～50%)或者達(dá)到壓力上限時(shí)(15～20psi),試驗(yàn)終止。

2 結(jié)果

2.1 Vmax 試驗(yàn)結(jié)果

從(表1)中可看出,隨著時(shí)間增加,濾器的載量逐漸升高,通量逐漸降低,但在各時(shí)間段料液的毒素絮狀單位與濾前相比沒(méi)有變化,均為120lf/ml,說(shuō)明Polysep II CGW3濾器對(duì)破傷風(fēng)毒素的吸附很小,損失可以忽略不計(jì)。濾前料液濁度為14.2NTU,過(guò)濾后為4.72NTU,說(shuō)明澄清過(guò)濾效果較好。

以t(min)為橫坐標(biāo),t/V(min/ml)為縱坐標(biāo)作出Vmax試驗(yàn)曲線圖如圖3,其R2值=0.9991>0.99,說(shuō)明Vmax逐漸堵塞模型的有效性。

表1 Vmax 試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 Vmax test date

表2 Pmax 試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Pmax test data

具有工藝時(shí)間限制的濾膜面積計(jì)算公式為:Area=Vb/Vmax+Vb/(QiTb)[3],其中Vb為工藝體積,Vmax為最大過(guò)濾體積,Qi為起始流量,Tb為工藝時(shí)間。

根據(jù)圖3,Vmax=1/0.0015=666.7ml,濾膜面積為13.8cm2,單位面積Vmax(即最大載量)=0.6667ml/0.00138m2=483.1L/m2。同理,Qi=1/0.0038=263.2ml/min=15.79L/h,單位面積的Qi=11442.0L/m2h。

與一般項(xiàng)目不同，科研項(xiàng)目通常具有研究周期長(zhǎng)、技術(shù)難度大、投資規(guī)模大、不可預(yù)見(jiàn)性大等特征。因此，科研項(xiàng)目管理的難度也較大。企業(yè)作為科研項(xiàng)目實(shí)施主體之一，應(yīng)該加強(qiáng)項(xiàng)目全過(guò)程管理、重視科研項(xiàng)目的轉(zhuǎn)化和推廣、加強(qiáng)科研項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)管理，提高科研項(xiàng)目管理的有效性。

若需2 h 內(nèi)完成6 00 L料液的過(guò)濾,所需的該種膜面積=V b/Vmax+Vb/(Qi×Tb)=1.27m2。若過(guò)濾時(shí)間為1h,則所需最低膜面積=1.29m2。

2.2 Pmax 試驗(yàn)結(jié)果

由（表2）可知,在過(guò)濾速度基本恒定的情況下,隨著過(guò)濾時(shí)間延長(zhǎng),過(guò)濾壓力逐漸增大,濾液濁度逐漸升高,濾器的載量升高,但各時(shí)間段料液的毒素絮狀單位與濾前相比沒(méi)有變化,均為120lf/ml,說(shuō)明Millistak+XOHC濾器對(duì)破傷風(fēng)毒素的吸附可忽略不計(jì)。濾前料液濁度為14.2NTU,過(guò)濾后為2.06NTU,澄清過(guò)濾效果好。

以載量為橫坐標(biāo),壓阻(psid/LMH)為縱坐標(biāo)作出Pmax曲線圖[4][5],如圖4:

由表2及圖4,Millistak+XOHC濾器過(guò)濾約1.2L后,濾器壓降上升至10psi,若要求600L料液過(guò)濾時(shí)間為1h,根據(jù)圖4中公式可計(jì)算出濾器最大載量為349L/m2,則使用最低濾膜面積為1.72m2。若延長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間為2h,則濾器載量可提高至511L/m2,最低濾膜面積為1.18m2。

2.3 比較

由(表3)可看出,Millistak+X0HC濾器和Polysep II CGW3濾器對(duì)破傷風(fēng)毒素的吸附都很小,Millistak+ X0HC濾器的澄清過(guò)濾效果要優(yōu)于Polysep II CGW3濾器。

若要求1～2小時(shí)內(nèi)完成600L料液的過(guò)濾,根據(jù)計(jì)算結(jié)果得出(表4),Millistak+X0HC濾器的最大載量受過(guò)濾時(shí)間的影響較大,過(guò)濾時(shí)間越短,要求濾器的膜面積越大;而Polysep II CGW3濾器的最大載量受過(guò)濾時(shí)間的影響很小。

2.4 放大應(yīng)用

根據(jù)兩種濾器的小量試驗(yàn)結(jié)果,兩種濾器對(duì)破傷風(fēng)毒素的吸附均很小,Millistak+X0HC濾器的澄清過(guò)濾效果要略優(yōu)于Polysep II CGW3濾器,但Millistak+X0HC濾器的載量受過(guò)濾時(shí)間的影響,對(duì)過(guò)濾條件的要求較高。Polysep II CGW3濾器的最大載量比較穩(wěn)定,且在實(shí)際生產(chǎn)中,須在最低需求面積基礎(chǔ)上設(shè)定一個(gè)1.2～1.5倍左右的安全系數(shù),濾液濁度還可以下降。故選擇Polysep II CGW3濾器進(jìn)行了放大試驗(yàn),與板框?yàn)V器過(guò)濾進(jìn)行比較,結(jié)果如表5:

表3 兩種濾器過(guò)濾結(jié)果比較Table 3 Comparison of the results of two kinds of filters

表4 兩種濾器需求面積比較Table 4 Comparison of the area of two kinds of filters

表5 放大試驗(yàn)結(jié)果Table 5 the results of scale-up test

3 討論

通過(guò)小量試驗(yàn)中兩種濾器在毒素吸附、濾液澄清度及膜面積等方面的比較,初步篩選出Polysep II CGW3濾器進(jìn)行放大應(yīng)用,進(jìn)一步驗(yàn)證了其小量試驗(yàn)結(jié)果。

通過(guò)表5,可得出Polysep II CGW3濾器與板框?yàn)V器的比較:(1)Polysep II CGW3濾器過(guò)濾后濾液濁度雖略高,但對(duì)后續(xù)的超濾濃縮無(wú)明顯影響;(2)Polysep II CGW3濾器過(guò)濾損失很小,只有板框?yàn)V器過(guò)濾損失的1/20;(3)Polysep II CGW3濾器縮短了整體工藝時(shí)間;(4)從經(jīng)濟(jì)上考慮,板框?yàn)V器使用的濾板為一次性使用,成本較高;(5)Polysep II CGW3濾器為密閉式,大大提高了對(duì)制品和環(huán)境的安全性,符合GMP要求。因此,綜合考慮安全、經(jīng)濟(jì)、效率等方面因素,Polysep II CGW3濾器可替代板框?yàn)V器用于實(shí)際生產(chǎn)。

生物制藥業(yè)是目前發(fā)展最活躍、進(jìn)展最快的產(chǎn)業(yè)之一,21世紀(jì)是生物制藥行業(yè)飛速發(fā)展的時(shí)代,但中國(guó)的生物制藥業(yè)發(fā)展水平仍比較落后,其中支撐技術(shù)和設(shè)備的落后是一個(gè)主要原因。因此,亟需加強(qiáng)生物制藥行業(yè)的相關(guān)技術(shù)及裝備的產(chǎn)業(yè)化、國(guó)際化,不斷促進(jìn)技術(shù)裝備更新?lián)Q代,中國(guó)生物制藥業(yè)才能得到更快更好的發(fā)展。

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