林子豪，羅鼎峰，戚 平，毛新武

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

近年來(lái)，蘑菇中毒事件在我國(guó)常有發(fā)生，其致死率高達(dá)90%以上[1]，主要由鵝膏肽類毒素引起[2]。鵝膏肽類毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在烹飪過(guò)程無(wú)法破壞其毒性[3]。按結(jié)構(gòu)分類，鵝膏肽類毒素可分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘素3大類[4]，其中鵝膏毒肽主要有α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽，鬼筆毒肽以羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽為主。鵝膏肽類毒素進(jìn)入人體后，如果不及時(shí)發(fā)現(xiàn)和采取治療，將會(huì)引起肝腎功能衰竭而死亡，因此建立快速準(zhǔn)確、靈敏度高的鵝膏肽類毒素分析方法對(duì)預(yù)防蘑菇中毒和搶救中毒患者具有重要意義。

目前，鵝膏肽類毒素的檢測(cè)方法以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-7]為主，其樣品前處理主要采用固相萃取法[8-10]，但該前處理方法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，不適用于中毒應(yīng)急檢驗(yàn)。QuEChERS凈化方法簡(jiǎn)便快捷，在農(nóng)獸藥殘留[11-12]和非法添加物[13-14]檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用。四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜相比四極桿串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的分辨率，可以降低樣品基質(zhì)的干擾，進(jìn)一步提高方法準(zhǔn)確性[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化前處理方法和儀器條件，建立毒蘑菇中5種鵝膏肽類毒素的液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法，為食品中毒應(yīng)急檢驗(yàn)提供技術(shù)支撐保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；5種鵝膏肽類毒素購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司（純度均≥ 90%）。

Waters Xevo Q-TOF液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters 公司；旋渦振蕩混合器，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Allegra X-30R冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5種鵝膏肽類毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存；分別移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用水配制成濃度為10～200 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎均質(zhì)處理的樣品1.0 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，于旋渦振蕩混合器上渦旋5 min，以10 000 r/min離心5 min；取1 mL上清液置于2 mL離心管中，分別加入25 mg無(wú)水硫酸鈉和C18凈化劑，旋渦1 min后，10 000 r/min離心5 min。吸取1 mL凈化液，用水稀釋至10 mL，過(guò)膜，待測(cè)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈；梯度：0～2 min，8%B；2～3 min，8%～40%B；3～5 min，40% ～ 60%B；5～ 7 min，60% ～ 80% B；7～7.1 min，80%～8%B；7.1～10 min，8%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：ESI+；掃描范圍：m/z為50～1 000；電噴霧離子源溫度為120 ℃；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流量為800 L/h；錐孔氣流量為50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

由于α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的分子量?jī)H相差1 Da，α-鵝膏毒肽含有約43%的13C同位素，因此這兩種毒肽需要在色譜上進(jìn)行基線分離。考察了乙腈-水和乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽在以乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)無(wú)法分離，在乙腈-水的條件下分離度較好。在乙腈-水的條件下，比較了5種化合物的[M+H]+和[M+Na]+的母離子信號(hào)響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)[M+Na]+的信號(hào)響應(yīng)均高于[M+H]+。5種鵝膏多肽的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 5種鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜條件

圖1 5種鵝膏肽類毒素的色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

目前，鵝膏肽類毒素的前處理方法主要采用固相萃取法，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，不適用于中毒應(yīng)急檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS凈化方法對(duì)提取液進(jìn)行凈化?？疾炝薈18、石墨化炭黑、PSA、無(wú)水硫酸鈉等4種常用凈化劑對(duì)目標(biāo)物的吸附情況（用量均為1 mL提取液加入25 mg凈化劑）。由圖2可知，PSA和石墨化炭黑對(duì)β-鵝膏毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽等有較強(qiáng)的吸附，C18和無(wú)水硫酸鈉對(duì)5種鵝膏肽類毒素基本沒(méi)有吸附。因此，本實(shí)驗(yàn)采用C18和無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行凈化。

圖2 4種凈化劑對(duì)5種鵝膏肽類毒素的吸附情況

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

5種鵝膏肽類毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（S/N=3）見(jiàn)表2。在10～200 ng/mL的范圍內(nèi)，5種鵝膏肽類毒素的相關(guān)系數(shù)均＞0.99，檢出限在0.03～0.36 mg/kg。按照實(shí)驗(yàn)步驟，選擇蘑菇空白樣品，進(jìn)行低、中、高加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，結(jié)果如表3所示。在2～10 mg/kg的加標(biāo)水平下，5種鵝膏肽類毒素的加標(biāo)回收率為90.1%～105.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～4.1%。結(jié)果表明，該方法滿足5種鵝膏肽類毒素的檢測(cè)需求。

表2 5種鵝膏肽類毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表3 5種鵝膏肽類毒素的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙腈為提取溶劑，結(jié)合QuEChERS凈化技術(shù)，建立了5種鵝膏肽類毒素的液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法。該方法快速簡(jiǎn)便，回收率高，能滿足定性定量需求，為食品中毒應(yīng)急檢驗(yàn)提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。