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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 青島 266003)

研究表明，腎臟缺血再灌注損傷(IRI)與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，而腎臟IRI的可逆性可能與生物體內(nèi)的抗氧化機(jī)制有關(guān)，血紅素加氧酶-1(HO-1)是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化蛋白[1]，氧化應(yīng)激反應(yīng)時能夠顯著表達(dá)。維生素C(VitC)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)是兩種抗氧化劑[2]，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用是否能夠增強(qiáng)HO-1的表達(dá)，減輕腎臟病理損傷，國內(nèi)外尚未有該方面的研究報道。本研究擬通過建立大鼠腎臟IRI模型，觀察兩種抗氧化劑對腎臟IRI保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，從而為臨床腎臟IRI的防治提供理論依據(jù)和防治策略。

1 材料和方法

1.1 材料來源

健康雄性Wistar大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量200～300 g(青島市藥檢所動物實(shí)驗(yàn)中心提供)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、缺血再灌注組(B組)、VitC預(yù)處理組(C組)、EPO預(yù)處理組(D組)、VitC并EPO預(yù)處理組(E組)共5組，每組10只大鼠。

1.2 儀器與和試劑

重組人EPO、VitC(上海信誼藥廠有限公司),兔抗鼠HO-1抗體、Envision二步法免疫組化檢測試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中山生物技術(shù)有限公司),丙二醛(MDA)、HO-1 ELISA試劑盒(青島沃爾森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動物模型的建立及各組的處理

A組只打開腹腔，游離雙側(cè)腎蒂但不夾閉。B組大鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h、飲水不限，建立腎臟IR模型[3]。C組和D組分別在夾閉腎蒂前2 h腹腔注射VitC(2 mmol/kg)和EPO(5 000 U/kg)。E組給予維生素C和EPO，其用藥方法分別與C、D組相同。

1.4 標(biāo)本收集及檢測方法

各組大鼠于腎臟IR后24 h，麻醉后摘眼球取血，并盡快留取腎組織。于收集標(biāo)本24 h內(nèi)檢測各組血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；采用HO-1、MDA的ELISA試劑盒分別檢測血清HO-1、MDA的水平；蘇木精-伊紅(HE)染色光的鏡下觀察腎組織的形態(tài)學(xué)變化；按照J(rèn)ABLONSKI等[4]方法，依據(jù)近端腎小管損傷的程度分為5級，每組選取50個視野，計數(shù)各個等級所在視野的個數(shù)，即記為各個等級的分?jǐn)?shù)，計分越高，表示腎小管損傷越嚴(yán)重。采用HPIAS-1000彩色圖像分析儀測定腎組織HO-1的表達(dá)，測定選定目標(biāo)區(qū)域的陽性密度(選定區(qū)域的陽性面積/選定區(qū)域)及陽性點(diǎn)的平均吸光度值，兩者的乘積即為各選定區(qū)域的陽性表達(dá)總量，取其平均值為每例標(biāo)本的陽性表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎功能變化

與A組大鼠比較，B、C、D、E組血清BUN、Scr水平均明顯升高(F=414.63、387.89,q=9.58～6 388.47，P<0.05)，E組大鼠血清BUN、Scr水平與B、C、D組比較，差異有顯著意義(q=18.33～5 572.02，P<0.05)。見表1。

2.2 各組血清HO-1、MDA水平比較

與A組相比，B、C、D、E組血清中HO-1、MDA水平均有明顯升高(F=315.73、38.97，q=16.83～55.52，P<0.05)；C、D、E組血清中HO-1水平均較B組明顯升高(q=51.39～169.43，P<0.05)，而MDA均較B組明顯下降(q=5.59～10.62，P<0.05)；與C、D組比較，E組HO-1水平顯著升高(q=118.03、119.17，P<0.05)，而MDA水平明顯下降(q=5.03、3.74，P<0.05)。見表1。

2.3 各組腎組織形態(tài)學(xué)變化及腎小管損傷評分

光鏡下A組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)基本完整。與A組相比，B組彌漫大片狀腎小管上皮細(xì)胞崩解，細(xì)胞碎屑堵塞管腔但腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，C、D組見到小灶狀腎小管上皮細(xì)胞壞死，E組僅見部分腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫。B、C、D、E組腎小管損傷評分與A組相比，差異有顯著意義(Hc=129.77，q=10.26～15.37,P<0.05)；C、D組腎小管損傷評分與E組相比，差異有顯著意義(q=12.07、16.91,P<0.05)；C組腎小管損傷評分與D組相比，差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、HO-1、MDA水平比較

表2 各組大鼠腎小管損傷程度計分比較(視野)

2.4 各組腎組織HO-1的表達(dá)與定量分析

肉眼觀察A組腎組織HO-1只有微量表達(dá)；B組與A組相比，HO-1表達(dá)稍增加，且胞漿局灶著色輕；C、D、E組呈彌漫性染色、且染色較重，其中E組最顯著。A、B、C、D、E組HO-1的表達(dá)水平分別為(7.01±0.50)%、(27.33±1.54)%、(56.22±1.55)%、(59.06±1.39)%、(92.99±2.44)%；與A組大鼠比較，其他4組HO-1的表達(dá)水平均明顯升高(F=2 040.00，q=28.23～119.32,P<0.05)；與B組大鼠比較，C、D、E組HO-1的表達(dá)水平均顯著升高(q=40.14～91.08,P<0.05)，其中E組升高最顯著，C、D兩組HO-1的表達(dá)比較差異無顯著性(P>0.05)。

3 討 論

腎臟IRI是指多種原因?qū)е卵褐袛嗷虿蛔闶鼓I臟缺血，恢復(fù)血流灌注時腎臟功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象[5]，臨床上腎移植、部分腎切除術(shù)等均會引起腎臟IRI。IR階段氧自由基大量釋放，引起組織損傷。MDA是一種過氧化終末產(chǎn)物，其水平可反映腎組織脂質(zhì)過氧化的程度[6]。本研究結(jié)果顯示，B組血清中MDA的水平明顯升高,提示氧化應(yīng)激增強(qiáng)可能是導(dǎo)致腎臟IRI的重要原因之一。

腎臟IR時大量氧自由基的釋放造成組織損傷，同時也啟動了機(jī)體的內(nèi)在抗氧化機(jī)制，其中HO-1是一種重要的抗氧化蛋白[7]，它作為一種重要的誘導(dǎo)型蛋白，在生理狀況下，HO-1在部分腎小管上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)，當(dāng)IRI時能夠大量表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。HO-1是催化血紅素的起始酶和限速酶，HO-1本身及其催化血紅素的代謝產(chǎn)物可以通過多層次、多方面的作用機(jī)制減輕氧化應(yīng)激帶來的損傷[8]。GUELER等[9]研究顯示，在腎臟缺血前給予HO-1阻斷劑錫原卟啉，單核巨噬細(xì)胞中HO-1的表達(dá)減少，腎組織損傷嚴(yán)重。另有研究顯示，誘導(dǎo)型HO-1表達(dá)具有一定的時效性，在夾閉大鼠雙側(cè)腎動脈30 min后再灌注24 h時HO-1表達(dá)達(dá)到高峰，超過24 h后HO-1表達(dá)開始下降[10]，因此，在腎臟IR早期誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)對保護(hù)腎臟功能至關(guān)重要。

VitC和EPO是兩種重要的抗氧化劑，探索其能否誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，與B組相比，VitC組能夠增強(qiáng)腎組織HO-1的表達(dá)，降低血中MDA的水平，腎臟病理損傷減輕。VitC對于腎臟IRI的保護(hù)機(jī)制較復(fù)雜，GENC等[11]認(rèn)為氧化應(yīng)激能夠使轉(zhuǎn)錄因子Nrf2與細(xì)胞骨架蛋白Keap 1解離、活化、轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，啟動HO-1等抗氧化酶基因的表達(dá)，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示，EPO組也能夠增強(qiáng)腎組織HO-1的表達(dá)，減輕腎臟病理損傷。關(guān)于EPO誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的確切機(jī)制尚不明確，CAL等[12]研究認(rèn)為，IR時EPO能夠與其受體特異性結(jié)合，引起蛋白酪氨酸激酶-2(Jak2)發(fā)生自體磷酸化，Jak2的激活可以引起包括促分裂原活化蛋白激酶途徑的磷酸化，而HO-1的誘導(dǎo)性表達(dá)也與促分裂原活化蛋白激酶途徑的磷酸化有關(guān)，推測EPO可能通過促分裂原活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。

此外，本研究還進(jìn)一步探討了VitC和EPO聯(lián)合應(yīng)用對腎臟IRI的作用。結(jié)果表明，與單用VitC或EPO相比，E組大鼠腎組織HO-1表達(dá)量顯著升高，血清MDA水平明顯降低，腎臟病理損傷程度明顯減輕，提示兩者聯(lián)合預(yù)處理對腎臟IRI具有協(xié)同保護(hù)作用，而其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，VitC和EPO能通過多種途徑誘導(dǎo)腎組織HO-1表達(dá)增加，抑制氧化應(yīng)激，從而在腎臟IRI中發(fā)揮保護(hù)作用，且兩者聯(lián)合應(yīng)用時這一作用更為顯著，這為臨床腎臟IRI的防治提供了更加廣闊的思路。

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