宋維霞

（青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042）

0 前 言

石油資源短缺、環(huán)境污染嚴重，已經(jīng)成為制約我國可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。利用生物方法生產(chǎn)的生物乙醇，是傳統(tǒng)燃料石油最有前景的替代品。目前，世界上生產(chǎn)生物乙醇的原料大多數(shù)是淀粉和甘蔗汁，而以玉米為原料生產(chǎn)的第一代生物燃料乙醇，由于與人類競爭糧食，已逐漸被淘汰[1]。從豐富的農(nóng)副產(chǎn)品和工業(yè)廢渣 (如甘蔗渣、玉米秸稈、小麥和水稻秸稈、木屑等)中獲得的木質(zhì)纖維素,都可用作生產(chǎn)生物乙醇的原料。

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成。原料不同各部分的組成也會有所變化[2]。纖維素結(jié)晶形成的超細纖維結(jié)構(gòu)即無定形結(jié)構(gòu)，不易被真菌和細菌分泌的糖化酶水解。雖然經(jīng)過化學和物理方法預(yù)處理后的纖維素和半纖維素更容易和糖化酶反應(yīng)，但是由于纖維素的結(jié)構(gòu)相對堅固，因此，尋求有效的纖維素水解方法仍然是利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵[3]。

纖維素水解成可溶性的糖，需要包括內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（包括纖維二糖水解酶（CBH）、纖維糊精酶）和 β-葡萄糖苷酶（BGL）的共同作用，然而反應(yīng)產(chǎn)物如纖維低聚糖和葡萄糖會抑制纖維素酶的活性[4]。為了避免上述的產(chǎn)物抑制，將生物質(zhì)水解產(chǎn)生還原糖與還原糖發(fā)酵一起進行，這一過程被稱為同步糖化發(fā)酵（SSF）。這樣一方面，可以在纖維素酶的作用下將釋放的還原糖直接轉(zhuǎn)化為乙醇；另一方面，培養(yǎng)基中的葡萄糖的消耗和乙醇的存在將降低染菌的風險。聯(lián)合生物加工（CBP）工藝是將酶的生產(chǎn)、糖化和發(fā)酵集合成一體的新工藝。具有消耗低、操作簡單等優(yōu)點。最近，CBP已經(jīng)作為一個生物乙醇生產(chǎn)系統(tǒng)得到了認可，并且已經(jīng)開發(fā)了能夠有效地水解纖維素、提高乙醇生產(chǎn)能力CBP微生物。

SSF和CBP工藝的瓶頸在于糖化和發(fā)酵階段所需的最佳溫度不同。纖維素糖化酶的最佳溫度為50℃，而大多數(shù)微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的最佳溫度是28～37℃。筆者將重點論述利用耐高溫酵母菌的SSF和CBP工藝。由于同步糖化發(fā)酵需要較高溫度，所以還特別強調(diào)了能在CBP工藝中直接將纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇的酵母菌的發(fā)展情況[5]。

1 耐高溫酵母菌同步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇

因為在高溫條件下生產(chǎn)乙醇有很多優(yōu)點如：降低冷卻成本、低壓下乙醇能從發(fā)酵液中連續(xù)蒸發(fā)、降低染菌風險、在熱帶國家有較好適用性、緩解纖維素酶的產(chǎn)物抑制、提高同步糖化發(fā)酵（SSF）的效率等，因此在世界上已備受關(guān)注。Abdel-Banat等[6]計算出利用α-淀粉酶水解淀粉生產(chǎn)燃料乙醇，當發(fā)酵溫度增加5℃時，由于減少冷卻的能量，可以大大減少發(fā)酵成本。由于發(fā)酵過程中乙醇被蒸發(fā)，所以乙醇的濃度保持在較低水平，對酵母菌并沒有毒害，同時也可以簡化后續(xù)的精餾操作。

同步糖化發(fā)酵工藝（SSF）的一個突出的優(yōu)點是能避免葡萄糖對纖維素酶的抑制進而提高糖化效率和乙醇產(chǎn)量。然而，SSF工藝的缺點是在較低的溫度下水解反應(yīng)和發(fā)酵同時進行比水解和發(fā)酵單獨進行時水解效率低。因此，分離篩選在糖化溫度下產(chǎn)乙醇的耐熱菌是提高同步糖化發(fā)酵效率所必需的。耐熱酵母菌克魯維酵母（Kluyveromyces）和釀酒酵母（Saccharomyces），在高溫（＞ 40 ℃）下能產(chǎn)生超過5%的乙醇[7]。因為木糖是半纖維素中最常見的戊糖，是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中第二個最豐富的多糖。因此如果菌株除了耐熱之外還能夠直接以木糖為原料進行發(fā)酵，那么將使以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇變得更加經(jīng)濟可行。

一些耐高溫和產(chǎn)乙醇的酵母已經(jīng)被優(yōu)化,用來更好的從生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇（表1）。例如，耐熱畢赤酵母：多形漢遜酵母 （Hansenula polymorpha），在溫度升高到 37℃或較高時能夠分解葡萄糖、纖維二糖和木糖生產(chǎn)乙醇。Dmytruk等[8]通過對內(nèi)源性木糖還原酶基因進行定點突變，從而提高多形漢遜菌對木糖的利用。在48℃時，重組菌株比野生型菌株產(chǎn)乙醇的量高7.3倍。多形漢遜酵母菌的這種性質(zhì)是SSF應(yīng)用中的優(yōu)點。

馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxianus）在同步糖化發(fā)酵工藝中非常有應(yīng)用前景。已經(jīng)得到的多株馬克斯克魯維酵母，能在溫度高達45～52℃時生長，在溫度介于38℃和45℃時能有效地生產(chǎn)乙醇。耐熱的馬克斯克魯維酵母菌IMB3，在42℃時能發(fā)酵產(chǎn)生60～72 g/L的乙醇，這和工業(yè)上經(jīng)常使用釀酒酵母發(fā)酵得到的乙醇濃度相差無幾[9]。此外，馬克斯克魯維酵母在高溫下生長率高、可以利用各種糖原料（例如：阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖）生產(chǎn)乙醇。正是由于具有這些優(yōu)點，馬克斯克魯維酵母已用于以工業(yè)相關(guān)的基礎(chǔ)原料（如甘蔗汁、青貯玉米汁、糖漿和乳清粉）生產(chǎn)乙醇。此外，還應(yīng)用于將經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理的各種木質(zhì)材料（楊樹、桉樹、甜高粱、甘蔗渣和小麥秸稈）轉(zhuǎn)化為乙醇。同步糖化發(fā)酵實驗在42℃、100 g/L底物和15 FPU/g商業(yè)纖維素酶條件下進行，經(jīng)過72～82 h發(fā)酵木質(zhì)纖維素產(chǎn)生16～19 g/L乙醇?；陬A(yù)處理材料中葡萄糖的可利用量，乙醇產(chǎn)量為理論產(chǎn)量的50%～72%[10]。Banat等[11]驗證40℃至50℃有利于馬克斯克魯維酵母IMB進行同步糖化發(fā)酵。耐熱的馬克斯克魯維酵母菌IMB3通過SSF工藝將進行水熱預(yù)處理的柳枝稷轉(zhuǎn)化為乙醇。通過條件優(yōu)化，在45℃條件下，80 g/L的纖維素經(jīng)過168 h發(fā)酵，產(chǎn)生 22.5 g/L的乙醇,接近于理論產(chǎn)量的86%。

表1 在高溫下耐熱菌株通過SSF或CBP工藝水解纖維素和半纖維素生產(chǎn)乙醇的最新數(shù)據(jù)資料

最新分離出的耐熱的產(chǎn)乙醇菌即畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）IPE100，在 42 ℃利用葡萄糖產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量為的理論產(chǎn)量的85%。42℃時利用酶水解經(jīng)過發(fā)酵蒸汽爆破預(yù)處理過的玉米秸稈，乙醇產(chǎn)量為理論產(chǎn)量的93.8%。Kitagawa等[12]在耐酸、耐乙醇，耐熱菌畢赤酵母中構(gòu)建了一個棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶bgl基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化株在40℃，無需加入β-葡萄糖苷酶（BGL）的條件下，經(jīng)72 h同步糖化發(fā)酵100 g/L微晶纖維素，產(chǎn)生29 g/L的乙醇。P.kudriavzevii基因工程菌需要較少量的糖化酶，因此可以大大降低同步糖化發(fā)酵工藝中酶的成本。發(fā)酵過程中的各種形式的壓力包括低pH值和預(yù)處理產(chǎn)生的酸性發(fā)酵抑制劑（如醋酸，甲酸和乙酰丙酸）都會損害同步糖化發(fā)酵中的酵母菌，而酵母菌P.kudriavzevii的綜合忍受能力有明顯優(yōu)勢。耐熱的畢赤酵母菌在40℃條件下，發(fā)酵含有141 g/L蔗糖、15 g/L葡萄糖和9 g/L的果糖的甘蔗汁，產(chǎn)生71.9 g/L的乙醇。另外，畢赤酵母用于連續(xù)四個批次發(fā)酵后，仍然保持較高的生物活性。Oberoi等[13]報道了使用新分離的P.kudriavzevii HOP-1菌株通過SSF工藝以堿處理的秸稈為原料生產(chǎn)乙醇。在40℃時條件下P.kudriavzevii發(fā)酵150 g/L葡萄糖是傳統(tǒng)的釀酒酵母產(chǎn)乙醇的35%；而在45℃時則在200%以上。 用酶（20 FPU/g-纖維素酶，50 IU/g-β-葡萄糖苷酶和15 IU/g-果膠酶）水解堿處理的稻草，40℃時加入P.kudriavzevii進行同步糖化發(fā)酵，24 h后，乙醇濃度為24.25 g/L，是基于葡聚糖的理論產(chǎn)量的82%。

工業(yè)上常用來生產(chǎn)乙醇的釀酒酵母（S.cerevisiae），具有很高的乙醇耐受性，但不耐熱。用校對缺陷DNA聚合酶或紫外線 （UV）照射進行篩查，獲得耐熱性的突變菌株，釀酒酵母突變體可在溫度高達40～42℃時生長。通過基因組重排、原生質(zhì)體融合和紫外光照射相結(jié)合的方法提高了耐熱性、耐乙醇的釀酒酵母生產(chǎn)乙醇的效率。從熱帶地區(qū)分離出耐高溫釀酒酵母菌S.cerevisiaeTJ14，顯示出高溫（41℃）的生長表型。在42℃條件下，在利用同步糖化發(fā)酵過程中使用絲狀菌孢霉產(chǎn)生的纖維素酶水解發(fā)酵含有66%的葡聚糖的161 g/L的造紙污泥有機材料，能夠產(chǎn)生40 g/L的乙醇。Harashima等[14]基于耐高溫釀酒酵母菌經(jīng)典遺傳分析，RSP5編碼的E3泛素連接酶和CDC19編碼的丙酮酸激酶，負責菌株的高溫生長。

2 釀酒酵母中的纖維素酶基因的異源表達

CBP工藝中理想的微生物應(yīng)能糖化纖維素并利用糖生產(chǎn)酒精。由于釀酒酵母發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇具有許多優(yōu)點，例如：糖的消耗速度更快、乙醇產(chǎn)量高、乙醇和各種抑制劑的耐受性強。同時，釀酒酵母易于遺傳操作并且長期用于食品和飲料工業(yè)，被公認是安全的，所以釀酒酵母是CBP工藝中常用的菌種。

在一般情況下，結(jié)晶纖維素的高效降解需要水解酶的協(xié)同反應(yīng)，如內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、纖維二糖水解酶（CBH）和 β-葡萄糖苷酶（BGL）[4]。 由內(nèi)切葡聚糖酶優(yōu)先在纖維素的無定形區(qū)進行隨機切割，產(chǎn)生還原性和非還原性末端，然后由纖維二糖水解酶作用釋放出纖維二糖；隨后在EG-CBH內(nèi)切外切酶協(xié)同作用下纖維素可被高效降解為可溶纖維二糖和纖維寡糖[15]。最后在β-葡糖苷酶的作用下將纖維寡糖分解為葡萄糖分子。由于纖維二糖和纖維低聚糖是纖維素水解的強效抑制劑，是纖維素水解過程的限速步驟,BGL則可以將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。來源于真菌的BGL基因 （如從A.aculeatus獲得的BGL1、從Saccharmycopsis fibuligera獲得的BGL1、從黑曲霉獲得的bglA、從Candida wickerhamii獲得的bglB、從 Trichoderma reesei獲得的 bgl、和從 Endomyces fibuliger獲得的BGL1）已在釀酒酵母中異源表達。Gurgu等[16]報道：攜帶S.fibuligeraBGL1基因的工業(yè)酵母菌利用纖維二糖的能力取決于其積累BGL1的能力也取決于其遺傳背景。重組的釀酒酵母菌能夠表達纖維糊精轉(zhuǎn)運基因與分解纖維二糖和纖維糊精的細胞內(nèi)BGL基因，通過細胞在細胞外BGL將纖維糊精完全水解成葡萄糖。這意味著以纖維糊精為原料生產(chǎn)乙醇的效率已經(jīng)被提高。

纖維素酶直接參與纖維素水解反應(yīng)，通過纖維素酶基因的共表達能夠使纖維素直接生產(chǎn)乙醇。Den-Haan等[17]表達了兩個纖維素酶基因，從T.reesei中獲得的編碼 EG的基因和從S.fibuligera中獲得的編碼BGL的基因，兩個基因整合在釀酒酵母中得到的酵母菌，成功地以無定形纖維素（PASC）作為唯一的碳源生產(chǎn)乙醇。最近，基因編碼的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶（EGII）、酸性纖維素酶II（CBH II）和棘孢曲霉BGL1基因通過具有攜帶抗抗生素G418基因的單一載體集成到葡萄酒酵母菌的染色體上。重組得到的釀酒酵母菌可以直接利用經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈纖維素生產(chǎn)乙醇，而不需要額外的加入各種酶。

3 細胞表面工程技術(shù)的應(yīng)用

細胞表面工程，將目的蛋白和酵母的細胞壁蛋白融合表達，使目的蛋白固定在酵母細胞的表面。比較常用的細胞壁蛋白有α-凝集素和Flo1p蛋白[18]。細胞表面表達不僅可以有效提高酶活力的穩(wěn)定性，而且還可以將表達、純化和固定集合于一體，節(jié)省時間和資源[19]。Fujita等[20]利用純的纖維素原料如大麥β-葡聚糖和無定形纖維素生產(chǎn)乙醇，使用重組釀酒酵母菌細胞表面表達的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶 （EGII）和酸性纖維素酶II（CBH II）和棘孢曲霉BGL1而沒有而沒有添加其他的酶。利用無定形纖維素生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量為0.45 g/g，是理論產(chǎn)率的88.5%。最近，一個表達分解纖維素酶的二倍體酵母重組株被優(yōu)化，在不添加外源酶的條件下，分解經(jīng)過熱水預(yù)處理的100 g/L的水稻秸稈產(chǎn)生7.5 g/L乙醇。

利用酵母菌細胞表面工程表達纖維素酶具有以下優(yōu)點：①在細胞表面有多種纖維素酶協(xié)同水解纖維素，可增加糖的利用率產(chǎn)生更多的乙醇；②水解纖維素釋放的葡萄糖被酵母細胞表面吸收，糖濃度維持在較低水平，以減少污染、降低纖維素酶產(chǎn)物抑制的風險；③由于在培養(yǎng)基中的葡萄糖穩(wěn)態(tài)濃度可以保持接近于零，因此可減少葡萄糖的阻遏作用，促進木糖的消耗；④酵母細胞酶的回收利用，降低酵母繁殖成本、減少酶的消耗[21]；⑤纖維素酶自動固定化在酵母細胞表面上，只要酵母繼續(xù)生長，該酶的活性則得以保持。

4 耐高溫酵母菌株在提高CBP工藝方面的應(yīng)用

纖維素酶的異源產(chǎn)物已經(jīng)以耐熱酵母菌為宿主得到表達。例如，一些外源基因已被引入馬克斯克魯維酵母并成功的得到表達。耐熱纖維素酶基因編碼的黑曲霉EG、嗜熱子囊菌BGL和CBH被引入馬克斯克魯維酵母NBRC1777基因組。馬克斯克魯維酵母中的相關(guān)基因，在甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）啟動子的控制下成功的得到表達，并且酵母在溫度高達45～50℃生長良好。重組菌株能夠利用100 g/L的纖維素產(chǎn)生43.4 g/L乙醇[22]。

為了提高纖維素的轉(zhuǎn)化效率，從里氏木霉中獲得的EGII和從棘孢曲霉中獲得的BGL1被共展示在重組馬克斯克魯維酵母細胞表面，在45℃條件下能夠利用53.4 g/L纖維二糖產(chǎn)生20.4 g/L的乙醇。在48℃、不加入其他纖維素酶的條件下，經(jīng)過12 h反應(yīng)，重組菌株能夠以10 g/L的纖維素β-葡聚糖為原料產(chǎn)生4.24 g/L乙醇；而在30℃條件下，乙醇量僅為0.930 g/L即產(chǎn)量（生產(chǎn)每克乙醇需要消耗的β-葡聚糖克數(shù)）為0.47 g/g。這一結(jié)果表明使用該重組耐熱馬克斯克魯維酵母菌的細胞表面顯示耐熱性的纖維素酶，可以有效地實現(xiàn)在高溫下發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇。作為一般認為是安全的（GRAS）微生物，馬克斯克魯維酵母，可在高溫下利用纖維素（見表1），因為它在較高的溫度下可以利用廣泛的碳源，迅速地進行生長繁殖。馬克斯克魯維酵母為改進CBP工藝、提高乙醇產(chǎn)量做出重大貢獻[23]。

半纖維素是木質(zhì)纖維素中第二豐富的成分，與纖維素一起被用來生產(chǎn)乙醇。Voronovsky等[24]通過將XYN2（里氏木霉中編碼木聚糖酶的基因）和xlnD（黑曲霉中編碼β-木糖苷酶的基因）整合到多形漢遜酵母基因組中，得到的轉(zhuǎn)化體在48℃能夠在以樺木木聚糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長并且產(chǎn)生乙醇。Sakamoto等[25]通過構(gòu)建重組的釀酒酵母直接以水稻秸稈半纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，不僅能通過內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶1的共同作用來水解半纖維素，也可通過表達出的樹干畢赤酵母木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和釀酒酵母中木酮糖激酶同化木糖。半纖維素降解酶在耐熱酵母菌細胞表面顯示出的應(yīng)用也將有助于提高以半纖維素為原料生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量。

5 結(jié)論與展望

通過基因工程獲得的具有纖維素水解活性的酵母使得利用CBP工藝以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇有突破性的提高。CBP工藝的主要缺點是糖化和發(fā)酵的最佳溫度的差異，而耐熱菌株的應(yīng)用可以克服這個缺點。耐高溫、產(chǎn)乙醇的酵母菌用于SSF工藝，使木質(zhì)纖維素在高溫下高效水解。有效的水解需要多種酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的結(jié)合并轉(zhuǎn)化進入耐熱酵母菌中，這需要高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。因此，構(gòu)建多基因表達系統(tǒng)仍是進一步研究的目標。

同時，細胞表面工程是在酵母細胞表面展示各種纖維素分解酶并有效地水解纖維素原料的有力工具，是應(yīng)用在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的一個新方向。已構(gòu)建的能夠利用木質(zhì)纖維素酵母菌，可有效地將來源豐富的纖維素廢料轉(zhuǎn)化新的生物能源，因此具有極其重要的意義。

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