謝麗萍，應(yīng)向賢，王一芳，鄭建永

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

0 引 言

酯酶(Esterase，EC3.1.1.1，羧基酯水解酶)是普遍存在于自然界的水解酶，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、洗滌劑化學(xué)合成及油脂等工業(yè)，具有廣泛的用途[1]。酯酶具有選擇性專一、催化效率高、副反應(yīng)少的特點，在手性藥物制備等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[2,3]。Nakagawa等[4]從菌株 Rhizobium sp.DS-S-51中克隆和表達(dá)了一個酯酶，該酶用于選擇性拆分4-氯-3-羥基丁酸酯，拆分后4-氯-3-羥基丁酸酯對映體的e.e.值大于99%。源自Enterobacter sp.DS-S-75的重組酯酶能耐受15%(w/v)的4-氯-3-羥基丁酸甲酯，選擇性拆分后R-4-氯-3-羥基丁酸甲酯的e.e.值大于99%[5,6]。作為生物催化劑，酯酶的催化性能往往不能滿足實際應(yīng)用的要求，而商品酶的價格往往較高，阻礙了它的進(jìn)一步應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)新型的酯酶，采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建酯酶的基因工程菌，對酯酶基因進(jìn)行重組表達(dá)，可大大降低酯酶生產(chǎn)成本，從而使之得到廣泛應(yīng)用。

本研究對一個巨大芽孢桿菌酯酶基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，利用親和層析實現(xiàn)了酯酶的分離純化，研究了該重組酯酶的酶學(xué)性質(zhì)，如pH、溫度、金屬離子、有機溶劑的影響等，為其在生物催化與轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒載體

實驗室篩選的Bacillus megaterium strain WZ009（已委托武漢微生物菌種保藏中心保藏菌種，CCTCC M 2011336），表達(dá)載體 pET-30a，大腸桿菌 Escherichia coli DH5α 與 E.coli BL21（DE3）均為本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

rTaq酶購自上海申能博彩生物科技有限公司。T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖電泳試劑均購自大連TaKaRa公司。Ni-NTA Sefinose Kit購自Bio Basic INC公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%NaCI，0.5%酵母浸出粉，pH 7.5。配制固體培養(yǎng)基時需加入1.5%的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.72%葡萄糖，0.7%酵母膏，0.125%CaCl2，0.1%四氯三羥基丁酸，pH 6.5。

大腸桿菌E.coli DH5α與E.coli BL21(DE3)采用種子培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。WZ009菌株采用發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h。重組克隆菌株用含卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的種子培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，重組表達(dá)菌用含100 μg/mL卡那霉素的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用終濃度為0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.1.4 引物

根據(jù)已知基因組序列的B.megaterium DSM319的酯酶基因 (GeneBank Accession No.CP001982) 設(shè)計引物，F(xiàn)(5’-ATGCCGTTAGATCCGCA-3’) 和 R(5’-CTAAATAGAATCAAATACTTGACG-3’)。引物由上海澤衡生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因bme的PCR擴增及表達(dá)載體pET30abme的構(gòu)建

挑取B.megaterium WZ009單菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至菌液OD600約為0.8，參照TaKaRa基因組DNA抽提試劑盒說明書提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，寡聚核苷酸F和R為引物進(jìn)行PCR擴增。該PCR擴增反應(yīng)體系總體積為50 μL，模板和引物添加量分別為100 ng和300 ng。擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94變性 35 s，57 ℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 50 s，35個循環(huán)；72℃后延伸10 min。

電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物并回收純化，用相應(yīng)的內(nèi)切酶Kpn I和Xho I進(jìn)行雙酶切，割膠回收，微量核酸蛋白測量儀檢測濃度，控制DNA片段摩爾數(shù)在載體的摩爾數(shù)的3～10倍，將目的片段與同樣酶切處理過的載體pET-30a混合，16℃下T4連接酶連接過夜，并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過卡那霉素抗性篩選和藍(lán)白斑篩選[7]，挑取陽性克隆子提取質(zhì)粒，用Kpn I和Xho I對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。取陽性克隆子送至上海生工生物工程有限公司測序，然后用Blast軟件將所得基因序列與GenBank中的基因序列進(jìn)行比對分析。

1.2.2 基因bme的表達(dá)

從陽性克隆子DH5α中提取重組質(zhì)粒pET30a-bme，并轉(zhuǎn)化入 E.coli BL21(DE3)中，在含卡那霉素的種子培養(yǎng)基中37℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12h，作為種子液。然后按1%的比例接種擴大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入24 mg/L的IPTG至終濃度為0.2 mmol，28℃，200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。

1.2.3 重組酶的純化

4℃下收集菌體，用50 mmol的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸，經(jīng)超聲破碎后4℃，10 000 r/min離心15min得上清粗酶液。按照Ni-NTA Sefinose試劑盒使用指南，取粗酶液上樣至預(yù)平衡的Ni2+柱中，依次用不同梯度的洗脫液洗脫目的蛋白。收集洗脫液，經(jīng)SDS-PAGE檢測樣品的蛋白質(zhì)純度。蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford法[8]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣。

1.2.4 重組酶酶活測定

取兩個試管 （分別是對照管和樣品管），各加0.1 mL溶液A和2.89 mL溶液B慢慢混合。50℃水浴中預(yù)熱5 min，然后在對照管里加入已滅活的酶液0.01 mL，樣品管里加入酶液0.01 mL，立即混勻計時。在水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2 min，并馬上測定410 nm下酶水解產(chǎn)生對硝基苯酚的吸光度值 （OD410 nm值）。溶液A：150 mg底物酯溶于50 mL異丙醇；溶液B：500 mL pH7.5 0.02 mol/L磷酸緩沖液。底物為對硝基苯酚乙酸酯和對硝基苯酚棕櫚酸酯。

酶活定義：在pH7.5，50℃條件下，每分鐘水解釋放1μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個酯酶活力單位(U)。

1.2.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)

(1)酯酶的最適反應(yīng)溫度

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，分別在25～90℃溫度范圍內(nèi)測定酶反應(yīng)，410 nm波長下測定各管吸光值并計算酶活力，以酶活最高者作為100%。

(2)酯酶的最適反應(yīng)pH

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，變化不同pH值的磷酸鹽緩沖液，410 nm波長下測定各管吸光值并計算酶活力，以酶活最高者作為100%。

(3)金屬離子對酯酶活力的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別添加不同金屬離子或EDTA，測定酶活力。確定金屬離子與EDTA對酶活的影響。以不加金屬離子時的酶活力作為100%，計算相對酶活力。

(4)有機溶劑耐受性

標(biāo)準(zhǔn)體系中按體積比分別為10%-80%加入甲醇作為助溶劑，檢測重組酶在有機溶劑存在條件下的酶活力。以未加甲醇時的酶活作為100%，計算相對酶活。

1.2.6 5 L發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)

將種子液按1%的接種量接入5 L發(fā)酵罐（BioStat C,德國 B.Branun）中，裝液量為 3 L，在37℃,200 r/min和通氣1.1 vvm的條件下培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，28℃進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)酵。每隔一小時取樣，用分光光度計檢測光密度(OD600)并記錄pH、溶氧值。

1.2.7 酶不對稱水解4-氯-3-羥基丁酸乙酯

在50 ml反應(yīng)瓶中先后加入20 mL 0.2mol/L磷酸緩沖液 (pH7.0)、0.2 mL 4-氯-3-羥基丁酸乙酯 （CHBE）、1 mL工程菌液，200 r/min,30℃下開始反應(yīng)，10 h后取樣分析。水解反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取，有機相無水硫酸鈉干燥、過濾后直接進(jìn)行氣相色譜分析。氣相色譜分析條件：進(jìn)樣口溫度250℃，分流比 20:1，載氣N2，載氣流量 1 ml/min；柱溫100℃保持2 min，2℃/min程序升溫至160℃，保持2 min；FID檢測器：檢測器溫度250℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組酶的表達(dá)與SDS-PAGE驗證

通過Kpn I和Xho I雙切點將酯酶bme基因引入表達(dá)載體pET-30a，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET30a-bme。將重組質(zhì)粒pET30a-bme轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coil BL21(DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下，酯酶在E.coil BL21(DE3)中高效表達(dá)，分子量約為41.5kDa，與預(yù)期相符。利用重組質(zhì)粒攜帶的多組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)的重組酶經(jīng)Ni2+親和色譜純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測，顯示為單一條帶(圖1)，實現(xiàn)了重組蛋白的一步純化。經(jīng)過酶活、蛋白質(zhì)濃度測定，計算得酶的比活為200 U/mg。

圖1 純化前后樣品的SDS-PAGE分析

2.2 酯酶酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 酯酶的最適反應(yīng)溫度

圖2結(jié)果表明，酯酶在70℃表現(xiàn)出最高活力。在25℃活力僅為最高活力的21.4%；隨著溫度的增加，活性有所提高；超過80℃后，活性開始降低，到90℃時活性僅為最高活性的16.7%。

圖2 溫度對酶活的影響

2.2.2 酯酶的最適反應(yīng)pH

圖3結(jié)果表明，該酶在偏酸性條件下(＜pH6.5)酶活力相當(dāng)?shù)?，不到最高酶活?0%。當(dāng)pH7.5時酶活達(dá)到最大值，所以該酶的最適pH為7.5。酯酶一般為中性蛋白，其最適pH一般都在中性的6.5～7.5范圍內(nèi)，適宜于中性介質(zhì)中應(yīng)用。

圖3 pH對酶活的影響

2.2.3 金屬離子對酯酶活力的影響

由表 1可知較高濃度的 Na+,Zn2+,Ca2+和EDTA對酶活有一定的抑制作用，但該酶能耐受低濃度的Zn2+,Ca2+,Mn2+,EDTA等，表明該重組酶具備良好的金屬離子耐受性。

表1 金屬離子對酶活的影響

2.2.4 有機溶劑耐受性

選用甲醇作為助溶劑，以未加甲醇時的酶活力為100%計算相對酶活力，結(jié)果如圖4所示。不同濃度的甲醇并不抑制酶活力，說明重組酶具有良好的有機溶劑耐受性。

圖4 有機溶劑耐受性

2.3 5L發(fā)酵罐擴培——發(fā)酵曲線

發(fā)酵過程曲線如圖5，pH隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其數(shù)值逐漸升高。溶氧曲線一開始下降迅速后又回升，發(fā)酵9 h時又降到最低，之后穩(wěn)定一段時間后又回身至較高值。說明發(fā)酵初期，耗氧量大，菌體攝氧量達(dá)高峰；發(fā)酵中期，耗氧相對較恒定，但此處也有所波動。OD600曲線逐漸升高，說明菌體生長良好正常。細(xì)菌生長進(jìn)入對數(shù)生長期，OD值明顯上升，達(dá)最大值，隨后增長緩慢。

圖5 BME 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵曲線

2.4 酶不對稱水解4-氯-3-羥基丁酸乙酯

圖6 手性氣相色譜圖

經(jīng)檢測得到如下氣相色譜圖6，a為樣品，b為標(biāo)樣。(R)-和(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯對映體出峰時間分別為：28.2 min和28.5 min。

以混旋4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，在30℃下重組酯酶BME催化水解10 h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為50%，底物e.e.值為70%，表明酯酶對4-氯-3-羥基丁酸乙酯水解具有立體選擇性。

本研究成功實現(xiàn)了一個巨大芽孢桿菌酯酶基因分子克隆與功能性表達(dá)，并對其進(jìn)行了擴大培養(yǎng)。經(jīng)分離純化得到了重組酯酶，該酶亞基分子量為41.5 kDa。重組酯酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，最適 pH為7.5，比酶活為 200 U/mg，比活力較高。該酶能耐受低濃度的Zn2+，Ca2+,Mn2+,EDTA等和高濃度的甲醇和Triton X-100。此外，該酯酶在不對稱水解4-氯-3-羥基丁酸乙酯中E值達(dá)到11.7。上述結(jié)果表明，本研究的酯酶在選擇性拆分上具有較好的應(yīng)用潛力，具有進(jìn)一步研究的價值。

[1]Bornscheuer U T.Microbial carboxyl esterase:classification,properties and application in biocatalysis[J].FEMS Microbiology Rev 2002,26(1):73-81.

[2]Patel J M.Biocatalytic synthesis of atorvastatin intermediates.J Mol Catal B:Enzymatic ，2009，61:123-128.

[3]Lee S H,Park O J.Uses and production of chiral 3-hydroxy-γbutyrolactones and structurally related chemicals[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,84:817-828.

[4]Nakagawa A,Suzuki T,Kato K,Shinmyo A,Suzuki T.Production of(S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate by microbial resolution using hydrolase from Rhizobium sp.DS-S-51[J].J Biosci Bioeng,2008,105:313-318.

[5]Nakagawa A,Idogaki J,Kato K,Shinmyo A,Suzuki T.Improvement on produ-ction of(R)-4-chloro-3-hydroxybutyrate and(S)-3-hydroxy-γ-butyrolactone with recombi-nant Escherichia coli cells[J].J Biosci Bioeng,2006,101:97-103.

[6]Nakagawa A,Kato K,Shinmyo A,Suzuki T.Asymmetric hydrolysis of 2-hydroxy-carboxylic esters using recombinant Escherichia coli[J].Tetrahedron-Asymmetry,2007,18:2394-2398.

[7]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

[8]Bradford M,M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72(1-2):248-254.