吳鵬飛，魏 春，沈江偉，徐 力，汪 釗

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

果膠酶（Pectinase）是一種復(fù)合酶，主要由植物和微生物合成。果膠酶的應(yīng)用范圍很廣，主要包括食品、環(huán)保、醫(yī)藥和紡織等領(lǐng)域[1-3]，特別是應(yīng)用于水果與農(nóng)副產(chǎn)品加工中，對(duì)于提高果汁的出汁率，改善過(guò)濾效果及澄清作用效果顯著[4]。果膠酶的生產(chǎn)有40多年的歷史，傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法采用固態(tài)發(fā)酵法，但固態(tài)發(fā)酵法存在設(shè)備放大困難，自動(dòng)化程度偏低，工藝參數(shù)不易控制等缺陷。且隨著國(guó)內(nèi)對(duì)果膠酶需求的增加及對(duì)外貿(mào)易的發(fā)展，果膠酶的需求日益迫切，固態(tài)發(fā)酵法在品質(zhì)及產(chǎn)量上難以滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求。而液態(tài)發(fā)酵工藝與固態(tài)發(fā)酵法相比具有易實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動(dòng)化生產(chǎn)，生產(chǎn)規(guī)模大，易控制等優(yōu)點(diǎn)[5-7]，為此進(jìn)行了黑曲霉WZW001的產(chǎn)果膠酶的液態(tài)發(fā)酵工藝研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）WZW001，由浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)方法：接種一環(huán)PDA斜面孢子至種子培養(yǎng)基，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)1天。接種3 mL種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)3天。無(wú)特別說(shuō)明，裝液量均為250 mL三角瓶裝30 mL。

葡萄糖土豆浸出汁培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯洗凈去皮，稱(chēng)取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min）。四層紗布過(guò)濾取濾液，加入200 g瓊脂及200 g葡萄糖，攪拌均勻，冷卻后補(bǔ)足水分至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/100 mL)：橘皮粉 1 g，麩皮 3 g，硫酸銨 1 g，KH2PO40.3 g，MgSO40.05 g，初始 pH 5.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100 mL)：橘皮粉 1.5 g，麩皮 2 g，硫酸銨 1.5 g，KH2PO40.3 g，MgSO40.05 g，初始 pH 5.0。

1.3 果膠酶活力的測(cè)定方法及定義[8]

粗酶液的制備：發(fā)酵液在4℃，10 000 r/min離心7 min后取上清液作為粗酶液，用于酶活力測(cè)定。

測(cè)定方法及定義：吸取0.2 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液于試管中，加入1.8 mL pH 3.5緩沖液配制的1%果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30 min后加2 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴10 min。冷卻后吸取0.5 mL定容至10 mL，搖勻，在550 nm下測(cè)定其吸光值。酶活力定義：果膠酶降解果膠每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源是重要的功能物質(zhì)，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)并考慮到經(jīng)濟(jì)性，選擇麩皮作為最佳碳源[9,10]。研究了不同麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果表明果膠酶活力隨著麩皮添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，麩皮的最適添加量為4 g。

2.1.2 不同氮源和添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)于微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響很大，因此研究了不同氮源對(duì)黑曲霉WZW001產(chǎn)果膠酶的影響。研究結(jié)果由圖2可知：有機(jī)氮源較無(wú)機(jī)氮源更有利于菌株產(chǎn)酶，原因可能是有機(jī)氮源（如蛋白胨和酵母膏）成分比較復(fù)雜，富含大量微生物生長(zhǎng)代謝必需的微量元素。

其中有機(jī)氮源蛋白胨為產(chǎn)酶最高的氮源，無(wú)機(jī)氮源磷酸氫二銨、硫酸銨其次，考慮到蛋白胨價(jià)格昂貴，不利于降低培養(yǎng)基的成本；此外硫酸銨易溶水，對(duì)發(fā)酵液粘度影響小，有利于發(fā)酵傳質(zhì)增加發(fā)酵液的含氧量，因此選擇 (NH4)2SO4為黑曲霉WZW001發(fā)酵產(chǎn)果膠的最適氮源。

圖1 麩皮添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖3 硫酸銨添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究了不同硫酸銨添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響，圖3可知果膠酶酶活力隨硫酸銨呈先上升后下降的趨勢(shì)，添加量1.0 g時(shí)，果膠酶活力最高，為最適添加量。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，合適濃度的無(wú)機(jī)氮源（以硫酸銨效果更好）能顯著提高產(chǎn)酶。

圖4 橘皮粉添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖5 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.3 誘導(dǎo)物添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

果膠是黑曲霉產(chǎn)果膠酶的誘導(dǎo)物，對(duì)產(chǎn)酶有很大的影響，考慮到純果膠價(jià)格昂貴，用富含果膠的橘皮粉替代果膠有利于降低發(fā)酵的成本，而且橘皮粉還可以提供其他營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)酶能力。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入0.5%橘皮粉時(shí)對(duì)酶活力的提高就有作用。研究結(jié)果表明當(dāng)橘皮粉添加量從0.5 g增加至2.0 g時(shí)，產(chǎn)酶逐漸增加。但是添加更多的橘皮粉將導(dǎo)致酶活力下降，橘皮粉最適添加量為2.0 g。

2.1.4 不同金屬離子及添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同金屬離子能促進(jìn)或者抑制微生物產(chǎn)酶，因此研究了不同金屬離子對(duì)黑曲霉WZW001發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響。研究結(jié)果如圖5可知：在金屬元素中CaCl2,CuSO4,KCl對(duì)產(chǎn)酶有較大的促進(jìn)作用，而鉬酸鈉則對(duì)菌株產(chǎn)酶有較強(qiáng)的抑制作用。

選擇CaCl2,CuSO4,KCl三個(gè)因素作為影響產(chǎn)酶的主要因子，在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選用L9(34)正交表進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，研究不同水平添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響。試驗(yàn)因素和水平如表1，結(jié)果和極差分析如表2。

表1 產(chǎn)果膠酶正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素和水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，A,B,C三因素中對(duì)菌株產(chǎn)果膠酶影響最大的因素為B（CuSO4），其次為 C（KCl），A（CaCl2）的影響最小。 分析結(jié)果表明A1B1C1為最佳組合，即黑曲霉WZW001發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的最佳金屬元素組合為CaCl20.02 g，CuS040.02 g，KCl 0.02 g。

2.2 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖6 不同溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

采用最適合培養(yǎng)基，研究了20℃，25℃，27℃，30℃，33℃，35℃，40℃溫度條件下對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖6可知，隨著溫度的上升酶活也在提高，在30℃時(shí)酶活達(dá)到最大，之后溫度繼續(xù)上升酶活下降。原因可能是在30℃之前，溫度升高菌體生長(zhǎng)和代謝能力加強(qiáng)，產(chǎn)酶能力上升；溫度繼續(xù)增加，導(dǎo)致菌體提前衰亡，菌體代謝受到影響，該菌株發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的最適溫度是30℃。

圖7 初始pH值至對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖8 不同接種量至對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究了初始pH值對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響。研究結(jié)果如圖7所示：發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶的最適pH 4～6，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，產(chǎn)果膠酶活力最高，為最適pH。

2.2.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在250 mL三角瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，研究了不同接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響。研究結(jié)果如圖8所示：隨著接種量的增大酶活反而降低，接種量為2 mL時(shí)產(chǎn)酶活力最高，果膠酶酶活力為54.65 u.mL-1。這可能是因?yàn)樵谟邢薜臓I(yíng)養(yǎng)成分中過(guò)高的接種量使得營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快，菌體的生長(zhǎng)受到抑制。

3 結(jié) 論

黑曲霉WZW001的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，以低成本的麩皮、橘皮粉農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，不僅產(chǎn)酶活力較高，而且成本低廉。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化可知，黑曲霉WZW001發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的最適培養(yǎng)基的組成為（g/100 mL）：麩皮4 g，硫酸銨 1 g，橘皮粉 2 g，K2HPO40.3 g，MgSO40.05 g,CaCl20.02 g，CuSO40.02 g，KCl 0.02 g； 最適發(fā)酵條件為：初始pH 6.0，發(fā)酵溫度30℃，接種量2 mL/100 mL。最終果膠酶活力可達(dá)54.65 u.mL-1，比優(yōu)化前提高了45.2%。

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