何寶龍，孫麗慧，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學 生環(huán)學院，浙江 杭州 310014）

5′-肌苷酸（Inosine-5′-monophosphate 即 5′-IMP）是核苷的磷酸酯類物質(zhì)，由堿基、核糖和磷酸組成。主要以二鈉鹽的形式作為食品增鮮劑，具有比谷氨酸鈉（味精）更鮮美的增鮮效應(yīng)；也可與味精混合使用，且具有相乘的協(xié)同效應(yīng)；其對甜味和肉味也有增效作用，對咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，因此在食品工業(yè)生產(chǎn)中越來越受到重視和歡迎[1-3]。同時，由于磷酸轉(zhuǎn)移酶法合成5′-IMP具有選擇性高和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，因而以肌苷為原料，通過磷酸轉(zhuǎn)移酶法合成5′-IMP已成為當前研究的熱點[4,5]。

本實驗室前期成功構(gòu)建了攜帶有來自Escherichia blattae磷酸轉(zhuǎn)移酶（AP/PTase）編碼基因的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT，可以高選擇性地使肌苷5’-位羥基磷酸酯化[6]。然而，在生物催化技術(shù)的開發(fā)過程中，關(guān)鍵在于如何有效提高生物催化劑的活力[7-9]。因此，必須對微生物的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，提高單位體積發(fā)酵液的酶活單位。本實驗以獲得高產(chǎn)重組核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶為目標，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成，為生物催化合成呈味核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT，本實驗前期構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0滅菌后補加終濃度為50 μg/mL卡那霉素。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取一環(huán)4℃保存的斜面菌種接入含50 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃，150 r/min條件下培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按4%接種量，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)至 OD600達到 0.6～0.8，加入0.1 mmol IPTG，28℃繼續(xù)培養(yǎng)10 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體。

1.4 靜息細胞轉(zhuǎn)化

取35 mL發(fā)酵液，離心收集菌體，生理鹽水(0.85%)洗滌2次，懸浮于10 mL醋酸鈉緩沖液(100 mmol，pH 4.0)中，同時加入1%底物肌苷及20%焦磷酸鈉，35℃,150 r/min反應(yīng)1 h。取樣1 mL，加入 200 μL 2 mol HCl終止反應(yīng)。離心后，取上清液檢測產(chǎn)物含量，每個樣品3次平行。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的測定

采用細胞干重法。

1.5.2 產(chǎn)物5′-肌苷酸分析方法

取一定體積的轉(zhuǎn)化液12 000×g離心5 min，利用高效液相色譜分析檢測5′-肌苷酸。色譜條件如下：色譜柱為 C18 硅膠柱（250 mm×4.6 mm）；流動相組成為10 mmol磷酸鉀：甲醇 為9：1；柱溫為室溫；檢測波長為245 nm；流動相流速為1 mL/min。

1.5.3 磷酸轉(zhuǎn)移酶酶活定義

酶活單位（U）定義為：在35℃,pH 4.0條件下，在1 min內(nèi)催化肌苷生成1 μmol 5’-肌苷酸所需要的酶量定義為1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基組成對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

2.1.1 甘油濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

實驗室前期實驗表明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加甘油有利于菌體生長和產(chǎn)酶，因此本實驗首先考察了甘油濃度對重組大腸桿菌的生長以及產(chǎn)磷酸轉(zhuǎn)移酶的影響。由圖1可見，當甘油添加量為7.5 g/L時，酶活及生物量都相對較高，分別達到123.4 U/L和3.13 g/L，當甘油濃度提高到20 g/L時，其酶活和生物量分別為78.6 U/L和3.48 g/L，相對甘油濃度為7.5 g/L時生物量有所增加但酶活有明顯的降低，因此，綜合產(chǎn)酶及生物量考慮，最終確定甘油的最佳濃度為7.5 g/L。

圖1 甘油濃度對菌體生長以及產(chǎn)酶的影響

2.1.2 氮源對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

蛋白胨和酵母粉作為有機氮源，其濃度對菌體生長和產(chǎn)酶影響很大，本實驗分別對這兩種有機氮源的濃度進行了考察，結(jié)果分別如圖2和圖3。由圖2可見，蛋白胨濃度從5 g/L上升到12.5g/L，菌體的酶活、生物量菌也隨之升高，當?shù)鞍纂藵舛葹?2.5 g/L時，菌體酶活達到最高，為125.6 U/L，此時生物量為3.2 g/L。蛋白胨濃度繼續(xù)提高，酶活呈下降趨勢，生物量繼續(xù)升高但趨勢微弱。最終確定蛋白胨的最佳濃度為12.5 g/L。

圖2 蛋白胨濃度對菌體生長及產(chǎn)酶的影響

從圖3可以看出，在較低濃度范圍內(nèi)，隨著酵母粉濃度的身高，酶活不斷上升，在10 g/L時達到最大值130.8 U/L，而生物量隨著酵母粉濃度的升高一直增大，故綜合酶活和生物量考慮，選取10 g/L為酵母粉的最佳濃度。

圖3 酵母粉濃度對菌體生長及產(chǎn)酶的影響

在優(yōu)化有機氮源的基礎(chǔ)上，本實驗還考察了NH4Cl,(NH4)2HPO4,NH4NO3,尿素和NaNO35種無機氮源對菌體生長及產(chǎn)酶的影響。然而，結(jié)果表明，無機氮源的添加均不利于菌體生長和產(chǎn)酶（實驗結(jié)果未列出），故在發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加無機氮源。

2.1.3 金屬離子對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

金屬離子在微生物的生長和生命代謝過程中，常作為輔基和激活劑。本實驗考察了不同種類金屬離子對菌體生長以及產(chǎn)酶的影響。從表1中可以看出，Mg2+對產(chǎn)酶有一定的促進作用，但對細胞生長并不利；而Zn2+的添加對菌體生長和產(chǎn)酶均有一定的促進作用；添加其他種類的金屬離子對細胞生長和產(chǎn)酶都有較為明顯抑制。因此，最終確定在培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的ZnCl2。

表1 金屬離子對菌株生長及產(chǎn)酶影響

2.2 E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT催化肌苷合成 5′-肌苷酸

E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化，酶活力提高后，進一步考察了其特異性選擇催化肌苷的效果(圖4)。將上述培養(yǎng)條件下獲得的發(fā)酵液離心得到的微生物細胞作為催化劑，用于合成5′-肌苷酸。在10 mL醋酸鈉緩沖液中，于35°C,150 r/min水浴搖床下反應(yīng)，定時取樣分析，結(jié)果表明該酸性磷酸酶具有選擇性磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，能使核苷的5′位磷酸酯化生成5′-肌苷酸。當肌苷濃度為10 g/L時，反應(yīng)1小時肌苷酸的摩爾收率達到83.3%。

圖4 E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT靜息細胞催化肌苷

3 結(jié) 論

研究了E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT的培養(yǎng)基成分對其生長和產(chǎn)核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的影響，通過單因素試驗，確定了最優(yōu)培養(yǎng)基為：甘油7.5 g/L，蛋白胨 12.5 g/L，酵母粉 10 g/L，NaCl 10 g/L，ZnCl2 0.1 g/L，初始pH值7.0。在該條件下，核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶酶活達到143.8 U/L，比優(yōu)化前提高了1.0倍。

利用該培養(yǎng)條件獲得的E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT菌體為生物催化劑，催化肌苷制備 5′-肌苷酸，反應(yīng) 1 h，5′-肌苷酸的摩爾收率達到83.3%，表明該核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對肌苷具有良好的活性。

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