羅發(fā)軍 趙世元 鐘振國(guó)

夜香樹(shù)，又名夜來(lái)香，茄科夜香樹(shù)屬植物(Cestrum nocturnum，Linn)。原產(chǎn)熱帶美洲,現(xiàn)廣植于熱帶、亞熱帶地區(qū),我國(guó)廣東、廣西、福建、云南均有栽培，每年開(kāi)花約6次，資源非常豐富。我們?cè)鴪?bào)道夜香樹(shù)提取物體內(nèi)外有較強(qiáng)地抗腫瘤作用[1-4]。本實(shí)驗(yàn)從夜香樹(shù)花中提取得到夜香樹(shù)花皂苷(以下簡(jiǎn)稱SSFCN)，體外培養(yǎng)人白血病K562細(xì)胞,用不同濃度的SSFCN處理K562細(xì)胞,MTT法檢測(cè)SSFCN對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SSFCN對(duì)K562細(xì)胞周期的阻滯作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人慢性髓源白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

1.2 夜香樹(shù)花甾體皂苷(SSFCN)的提取

取干燥的夜香樹(shù)花2.3 kg，用乙醇浸泡24 h，加熱回流提取，過(guò)濾，減壓濃縮得浸膏，乙醇浸膏用硅膠拌勻后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇回流提取，回收溶劑，獲得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。取正丁醇部位浸膏100 g，用硅膠拌勻后，采用硅膠柱色譜法分離，先用氯仿-甲醇梯度洗脫，經(jīng)簿層檢識(shí)后將相同的溶液合并，直至氯仿-甲醇比例為20∶1時(shí)，發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶析出，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿甲醇混合物液洗脫，甲醇重結(jié)晶。得到1種不定型的結(jié)晶物，該化合物的曲線下面積為99.56%。經(jīng)不同系統(tǒng)進(jìn)行薄層層析檢識(shí)、高效液相色譜法、酸性水解測(cè)定其糖苷基團(tuán)的結(jié)構(gòu)、光譜分析，結(jié)合氫譜和碳譜(600 MHz)元素分析表明，該化合物單體含C、H、O 3種元素等；含量達(dá)99.1%，經(jīng)鑒定為甾體皂苷類化合物。

1.3 主要試劑與儀器

新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；RPMI Medium 1640購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；MTT 、Hoechst33342染色Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒caspase-3、cytochtome c等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma，型號(hào)38) ；流式細(xì)胞儀(美國(guó)庫(kù)爾特公司)；倒置熒光顯微鏡(Nikon,型號(hào)TE20002U) ；倒置顯微鏡(Olym2pus,型號(hào)CK40) ；酶標(biāo)儀(B iocell,型號(hào)Sunris)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD)。

1.4 MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用[5]

RPMI 1640完全培養(yǎng)基(GIB-CO)、3%谷胺酰胺、卡那霉素750 mg/L，用緩沖液調(diào)pH至6.8～7.2，濾菌后4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞K562細(xì)胞，用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μl上述細(xì)胞懸液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,離心去上清液，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為60 μg/mL、30 mg/L、15 mg/L 、7.5 mg/L、3.8 mg/L的SSFCN(含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液)；陽(yáng)性對(duì)照組加入終濃度為60 mg/L的As2O3(含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液)，對(duì)照組則加入200 μl的10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基細(xì)胞懸液，每組4孔(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后離心棄上清，每孔加入200 μl新鮮配制的含0.2 mg/ mL MTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入200 μl /孔 DMSO，振蕩混勻后，用波長(zhǎng)為550 nm、參比波長(zhǎng)為450 nm的酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，測(cè)定時(shí)減去空白對(duì)照。按下列公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值) ×100%

1.5 流式細(xì)胞儀分析(PI染色法)[6]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液,分裝在培養(yǎng)瓶中,實(shí)驗(yàn)組加入SSFCN終濃度為30 μg/ml，對(duì)照組加等體積培養(yǎng)基,置于含5% CO2、37℃溫箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,離心收集細(xì)胞,然后用PBS液洗1次，加入70%乙醇4℃過(guò)夜；棄去70%乙醇,用PBS液清洗2次，加0.5ml PBS充分混勻細(xì)胞,加入終濃度為100 μg/ml RNAase A，37℃消化1 h,加入2 mmol/L,Hoechst 33258 2 μl和PI(propidium iodide)4℃染色1 h,然后在Epicsxl流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，氬離子激光器488 nm或514 nm波長(zhǎng)激發(fā);阻斷濾片為620 nm長(zhǎng)波通濾片。

1.6 K562細(xì)胞DNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳分析[7]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，分別接種于3個(gè)培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換含0.5%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液，24 h后加入0.5 mg/L SSFCN，陰性對(duì)照組平皿中加等量的DMSO(終濃度為培養(yǎng)總體積的1%)。加藥15 h后，用0.6 mL細(xì)胞裂解液(0.5% TritonX -100,5 mmol/L EDTA 、10 mmol/L Tri,pH 7.4)裂解細(xì)胞，然后用等體積的酚-氯仿提取3次，乙醇沉淀后，將DNA沉淀溶于20 l TE(pH 7.8)中，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳分析。紫外光下觀察“DNA條帶”并攝影。

1.7 Western blot 法檢測(cè)SSFCN處理K562細(xì)胞后AKt磷酸化水平

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液,分裝在培養(yǎng)瓶中,分別加入終濃度為30 μg/ml、15 μg/ml、7.5 μg/ml的SSFCN，對(duì)照組加等體積培養(yǎng)基,置于含5% CO2、37℃ 溫箱中培養(yǎng)72 h,離心收集細(xì)胞，分別加入200 μl預(yù)冷的蛋白裂解液，放置于4℃裂解60 min，冰浴下超聲裂解15 min，冷凍離心15 min，采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，分裝后置-70℃保存。取等量蛋白(20 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，先恒壓100V電泳20 min隨后150V電泳60 min，然后在250 mA的條件下電轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗過(guò)夜；加入相應(yīng)的生物素化Ⅱ抗(均為1∶2000稀釋)室溫2 h。再加入ABC復(fù)合物室溫30 min，加入DAB顯色液，實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SSFCN對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用

分別用濃度為60 μg/ml、30 μg/ml、15 μg/ml、7.5 μg/ml、3.75 μg/ml的SSFCN，處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞72 h后,采用MTT法檢測(cè)SSFCN對(duì) K562細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明，SSFCN對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)呈明顯抑制作用，呈濃度依賴性，濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，SSFCN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)，見(jiàn)表1。

表1 MTT法檢測(cè)不同濃度SSFCN對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用

2.2 SSFCN對(duì) K562 細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響

流式細(xì)胞儀分析，與對(duì)照組相比，30 mg/L SSFCN處理 K562 細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，G0/G1期細(xì)胞周期無(wú)明顯變化，S期細(xì)胞比例逐漸增大,從45.8%→49.3%→51.5%；G2+M期細(xì)胞比例逐漸減小,從19.1%→17.2%→14.5%；與對(duì)照組比較，細(xì)胞周期中細(xì)胞比例的改變以72 h最為明顯(G1期46.8%→34.1%,S期38.5%→51.5%，G2+M期沒(méi)有明顯的變化)。隨著藥物作用K562細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸增加，作用72 h，其凋亡率達(dá)31.2%，而對(duì)照組僅為4%～6%，兩組相比差異顯著，見(jiàn)表2，30 mg/L SSFCN處理K562 細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有明顯的亞倍體峰。

表2 30 mg/L SSFCN 作用不同時(shí)間對(duì) K562 細(xì)胞周期及凋亡的影響

2.3 DNA凝膠電泳分析

以30 μg/ml SSFCN作用K562細(xì)胞24 h、48 h、72 h 藥物誘導(dǎo)的DNA斷裂。結(jié)果表明，SSFCN 作用K562細(xì)胞24 h后，DNA沒(méi)有裂解成小分子DNA片段，作用48 h后，才觀察到“DNA ladder”，表明經(jīng)SSFCN處理后K562細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡(圖1)。

2.4 不同濃度SSFCN處理K562細(xì)胞72 h P-AKt表達(dá)水平變化

不同濃度SSFCN作用K562細(xì)胞后，AKt水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，P-AKt308和P-AKt473的磷酸化水平明顯下調(diào)，隨著SSFCN濃度的增高，其水平下調(diào)更加明顯(F=63.5，P<0.01)(圖2)。

圖1 SSFCN作用K562細(xì)胞不同時(shí)間的DNA凝膠電泳圖像

圖2 不同濃度SSFCN處理K562細(xì)胞72 h后P-AKt表達(dá)水平的變化

3 討論

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的主動(dòng)的細(xì)胞死亡過(guò)程，有其特征性的形態(tài)和生化特征，而細(xì)胞周期的阻滯與細(xì)胞凋亡、分化關(guān)系密切[8]。細(xì)胞通過(guò)2個(gè)限制點(diǎn)(G1/S和G2/M)保證細(xì)胞的忠實(shí)復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，通過(guò)激活限制點(diǎn)，分別導(dǎo)致細(xì)胞的G1期和G2期延遲，使細(xì)胞有時(shí)間完成復(fù)制前和有絲分裂的修復(fù)，以保證細(xì)胞高質(zhì)量的存活，當(dāng)損傷超過(guò)細(xì)胞的修復(fù)能力時(shí)，則促使細(xì)胞凋亡。本研究從細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳分析等來(lái)確認(rèn)SSFCN誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡發(fā)生。從MTT法抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，SSFCN各劑量組均能使K562細(xì)胞數(shù)量明顯下降，IC50<20 μg/ml，進(jìn)一步證實(shí)SSFCN體外抑瘤作用；本組流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果證實(shí)隨著SSFCN作用時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡增強(qiáng)；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)有DNA Ladder，再一次證實(shí)我們的假設(shè)。

PI3K是1種細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，AKt是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子，是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性，PI3K/AKt信號(hào)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、維持細(xì)胞生存等具有重要作用[9]。PI3K受到生長(zhǎng)因子刺激后被激活，對(duì)磷脂酰肌醇環(huán)上3位羥基進(jìn)行磷酸化生成PIP3，在磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶(PDK)的協(xié)助下，AKt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，促使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在Ser308和Thr308位點(diǎn)磷酸化激活，AKt活化后，其下游因子也被進(jìn)一步激活，對(duì)細(xì)胞周期、凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。已經(jīng)證實(shí)，多種腫瘤組織如肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌等組織中AKt異常激活[10-11],通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKt信號(hào)通路，才能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，加速死亡[12]。本組結(jié)果提示SSFCN作用于K562細(xì)胞后，可能負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/AKt信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

如上所述，SSFCN具有抑制K562細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡的能力，機(jī)制可能抑制K562細(xì)胞PI3K/AKt信號(hào)通路，從而抑制K562細(xì)胞增殖。本研究為開(kāi)發(fā)SSFCN治療慢性白血病提供理論依據(jù)。

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